基因工程技术操作.doc

1、基因工程技术操作1. 为什么要学习基因工程技术操作？1）只有在实验室才能真正学会和掌握基因工程的重要概念和相关原理。2）只有在实验室才能真正增长知识和才干。3）只有亲手做过的实验才能记忆犹新。2. 珍惜实验课的体会：1)基因工程实验的开设来之不易。2)实验课上的学习内容将为你今后的科学生涯打下宝贵的基础。3. 实验室常见的仪器设备及用途：1)纯水仪：用途：制纯水注意事项：防止爆炸，防止发水。2)天平：托盘天平（配平实用）电子天平（0.01、0.001、0.0001）3)磁力搅拌器（具有加热功能） 4）酸度计用途：配置药品 调 PH 值注意事项：防止腐蚀 保护电极4)高压灭菌锅（手动、半自动、全

2、自动）用途：灭菌。注意事项：使用前检查锅内水是否充足 使用前设定好灭菌的温度、压力和时间打开和关闭灭菌锅是注意同时旋转对称的螺旋至少待灭菌无稍微冷却后方可去除5)超低温冰箱（-80 。 C） 7）普通冰箱（-20 。 C）用途：用于贮藏药品、材料等。注意事项：确保冰箱门关严 防止冻伤6)超净工作台：用途：用于植物组织培养、微生物接种。注意事项：确保使用状态时紫外灯必须关闭保持清洁不要用酒精擦拭有机玻璃挡板7)恒温培养箱：用途：用于液体培养基中对细菌的培养注意事项：使用前调好温度计转速8)高速冷冻离心机（台式、立式）用途：用于 DNA、RNA 等提取过程中的高速冷冻离心注意事项：使用前要预冷，调

3、好温度转速等必须调平使用后要关电源，擦拭干净（离心机内部的水珠）9)PCR 仪：用途：用于基因扩增注意事项：使用前设好程序使用后关闭电源10)移液器：（0.21000l）用途：用于微量液体的移取注意事项：使用前必须看清楚量程，并在量程范围内使用。使用时要缓慢用力切记避免有机溶剂腐蚀枪杆使用后调至最大量程11)微波炉：用途：融化琼脂糖凝胶，或琼脂粉注意事项：注意微波时间避免污染物污染12)凝胶电泳装置：用途：用于核的电泳的检测注意事项：使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定拟使用的电压，电流等。使用时要戴 PE 手套，并注意不要产生大量的污染物。13)UV 投射仪及凝胶成像系统：用

4、途：用于核算条带的观察及照相注意事项：不要造成 EB 污染使用时要先开电源，再开紫外，关闭是相反。使用后将凝胶几时拿走放回收处，并使仪器内部保持清洁。14)烘箱：用途：用于烘干器皿注意事项：防止器皿水分过多，造成短路。塑料凳器皿切记不要高温烘烤玻璃器皿等高温烘烤后，注意及时断电，千万不能过夜。15)分子杂交炉：用途：用于 Southern、Northern 等分子杂交。注意事项：正确设定杂交温度，时间等。防止同位素遗漏，污染。16)恒温培养箱、培养室：用途：生物材料的培养注意事项：正确设定培养温度、湿度、光照时间等培养条件。防止培养箱，培养是污染。注意温度的调节。17)制冰机：用途：制碎冰。注

5、意事项：使用时先接通水源。使用后要关闭水源。18)蛋白质、核算分析仪：用途：测定核算及菌液的浓度。注意事项：使用时要先预热。使用前要调零。要调好光源。19)测序仪：用途：对核算进行测序。注意事项：防止污染、按程序操作。20)基因枪：用途：用于转基因。注意事项：无菌操作，保持清洁。 使用时检查是否漏气。21)其他：恒温水浴锅、研钵研杵、液氮罐、电炉子、通风橱、涡旋器、同位素室及暗室。4. 常见的有害化学物质：A苯酚、氯仿、异戊醇。B溴化乙锭（EB） 。C十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 。D焦乙酸二乙脂（DEPC）.E放射性元素 32P、 35S5. 安全规程：1)熟悉所有有害物质的标识。2)在

6、不知道正确操作程序时不要使用实验室的药品及仪器。3)不要认为扩大污染源，或随意丢弃污染垃圾。4)如果不小心将有害物质弄到皮肤或衣服上，马上采取有效措施处理。5)严禁在实验室吸烟、饮食、以免误事和吸入有害物质。6)不要穿拖鞋进实验室。实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备一：实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的方法和技术。二：实验原理：感受态细胞是经物理化学方法增强获取 DNA 能力的细菌细胞，其原理是处于 0。 C 的 CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，此时，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态。三：实验仪器及药品：1.仪器：制冰机、恒温摇床、天平、酸度计2.材料：大肠杆菌 DH5，10ml

7、离心管，1.5ml 离心管3.试剂：0.1mol/lCaCl 2溶液，80%甘油，LB 液体培养基（1L） ，pH7.0-7.3胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl10g。四：实验内容：1.用划线法将大肠杆菌 DH5 接种于无抗性固体培养基上，与 37。 C 倒置培养 1-2 天。2.从菌落上挑取一个单菌落接至 3ml 液体培养基中，37 。 C 振荡培养过夜。3.取 0.5ml 菌液转到一个装有 50mlLB 液体培养基的锥形瓶中，37 。 C 振荡培养 2-3h4.将菌液转移至 10ml 离心管中，冰上放置 10min。5.4。 C 离心 10min（4000r/min）回收细胞。

8、6.倒出上清液，将管倒置 1min，以便培养液洗尽。7.用冰冷的 2ml0.1mol/lCaCl2溶液悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min.8.4。 C 离心 10min（4000r/min）回收细胞。 （其上清）9.用冰冷的 0.1mol/lCaCl20.4ml 悬浮细胞（务必放在冰上）10.分装细胞：200l/份，加 30l 无菌甘油，混匀置-80 。 C 冰箱中保存，此细胞即为感受态细胞。思考题：1.感受态细胞制备过程中的注意事项？整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂 D

9、NA 所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 2.Ca2+感受态细胞中的作用？促进大肠杆菌转化。实验二 质粒 DNA 转化大肠杆菌实验目的：掌握质粒 DNA 转化大肠杆菌的方法技术。实验原理：转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于 0。 CCaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀呈球形，转化混合物的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物贴附于表面，经 42。 C短时间热击，促进细胞吸收 DNA 复合物，将细菌放置在培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新表型得到表达，然后将

10、细菌培养物涂在含有 Amp 的选择培养基中。实验仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温箱、-70 。 C 冰箱、水浴锅实验材料：大肠杆菌 DH5，PUC1g 质粒，离心管实验试剂：LB 固体培养基 20mg/ml X-gal40l 200mg/mlPTG40l实验内容：1.取 200l 新配的感受态细胞加入 DNA 2l 混匀，冰浴 30min，同时用 PUC1g 做两个对照：受体对照：200l 感受态细胞+2l 无菌水质粒对照：200l 感受态细胞 0.1MCaCl2溶液+2l 质粒 DNA2.将管放在 42。 C 冰浴中 90s。3.冰浴 2min。4.每管加 800l 液体培养基，培养

11、 45min5.加 4lIPTG 和 40lX-gal 混匀。6.将混合液移至含有 Amp（50mg/ml）的培养皿中，再用无菌涂布棒将菌液均匀涂满平板。7.将适当体积（100l）转化的感受态细胞涂在备好的培养基上。8.倒置平皿 37。 C 培养 12-16h，出现菌落。实验结果：含抗生素 不含抗生素 结果分析受体对照组DNA 对照组转化实验组转化数：=菌落数*稀释倍数*转化反应原液体积/涂菌板体积思考题：如何提高转化率？1）载体 DNA 及重组 DNA 2)受体细胞 3）转化操作 4）试剂纯度与器皿的洁净度 实验三大肠杆菌质粒 DNA 的提取实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌

12、质粒 DNA。实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们，在 pH 值介于 12.0-12.5 这个窄小的范围，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被断裂，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但现在两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密的结合在一起，当加入 pH4.8 的乙酸甲高盐缓冲液回复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 两条互补链仍保持在一起，因此，复兴迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会迅速而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，是染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，Pr-SDS

13、复合物等一起沉淀下来被除去。仪器材料与试剂：（1）：仪器：恒温摇床等。（2）：材料：葡萄糖，Tris、EDTA、SDS 等（3）：试剂：1.溶液 I： 50mmol/l 葡萄糖、25mmol/l 三羟基氨基甲烷 TrisHCL10mmol/l 乙二胺四乙酸 EDTA（去除细胞壁，保护 DNA ）2.溶液 II:0.4mol/lNaOH(10ml) 2%SDS(10ml)用前等体积混合(破坏细胞膜，使 DNA 变性)3.溶液 III:5mol/l 乙酸甲（60ml） 冰乙酸（11.5ml）水（28.5ml）（使溶液恢复中性，使质粒 DNA 复性）4.TE 缓冲液（10ml）：10mmol/lTr

14、isHCL 1mmol/lEDTA ddH2O(灭)5.70%乙醇，放-20 。 C 冰箱中用后即放回。6.胰 RNA 酶。7.凝胶加样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝。8.氯仿/异戊醇按 24:1 的体积进行配制。实验步骤：1.将 2l 含相应抗生素（50g/ml）的 LB 培养基加入到试管中，接入上述含质粒的大肠杆菌，37 。 C 振荡培养液。2.取 1.5ml 培养物倒入微量离心管中 4000r/min 离心 2min。3.吸取培养液使细胞沉淀，尽可能干燥。4.细胞沉淀悬浮于 100l 溶液 I 中，充分混匀，室温放置 10min。5.加 200l 溶液 II 盖紧管盖，混匀内容物，

15、将离心管放在冰上5min。6.加入 150l 溶液 III（冰上预冷） ，盖紧管盖，颠倒数次，是指混匀，冰上放置 15min。7.12000r/min 离心 5min，将上清液转移至另一离心管中。8.向上清中加入等体积氯仿/异戊醇。反复混匀，12000r/min 离心5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上吸干液体。9.向上请中加入 2 倍体积无水乙醇，混匀后，-20 。 C 放置 15-20min，12000r/min 离心 5min，倒上清液，把离心管倒放在吸水纸上吸干液体。10.用 1ml70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀振荡并离心倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11.加入 20lT

16、E 缓冲液，其中含有 20g/ml 的胰蛋白酶时 DNA 完全溶解-20 。 C 保存。操作要点：1.溶液 II 必须新鲜配制，最好使用一次，将剩余的液体弃掉。2.加入溶液 III 时，要把液体充分混匀，并在冰上孵育足够的时间，使沉淀完全，如果为充分将细菌裂解物与溶液 II 混匀，将会影响质粒 DNA 纯度。实验结果：大肠杆菌质粒 DNA 提取的质量好坏需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。思考题：1.为什么溶液 II 要现用现配？放置空气中的二氧化碳进入到氢氧化钠中，使氢氧化钠变性，降低溶液的 PH，增加了破碎细胞膜的难度。2.为什么加完溶液 II 要冰上放置？防止 DNA 变性。实验现象：加溶液

17、I：沉淀溶解，溶液浑浊加溶液 II：溶液稍澄清加溶液 III：白色絮状物生成加氯仿/异戊醇：（去除蛋白质）溶液分层无水乙醇作用：沉淀 DNA.70%乙醇作用：洗涤沉淀表面的异戊醇等杂质实验四 PCR 基因扩增实验目的：通过本次实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。实验原理：聚合酶链反应（PCR）的原理类似于天然复制过程，在待扩增的 DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物经变性、退火、延伸、若干个循环后，DNA 扩增 2n倍。1.变性：加热使模板 DNA 在高温（94 。 C）下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即为变性。2.退火：使溶液温度降至 50-60。 C，模板 DNA

18、 引物按碱基互补配对原则互不结合，即退火阶段。3.延伸：溶液反应温度升至 42。 C，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP）按 5， -3， 方向复制出互补的 DNA，即引物的延伸阶段。上诉 3 步为 1 个循环，即高温变性，低温退火，中温退火 3 个阶段，从理论上讲每经过 1 个循环，样品中的 DNA 量应增加 1 倍，新形成的链又可称为下一个循环的模板，经过 25-30 个循环后，DNA 可扩增106-109倍。典型 PCR 反应体系由以下部分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、Mg2+人工合成的 DNA 引物

19、 I、II 、耐热 Taq 聚合酶实验仪器：材料与试剂（一）仪器：PCR 热循环仪。（二）材料：DNA 模板、4 种 dNTP、引物 I、II 、Taq 酶、DNA 相对分子量标准物。（三）10%缓冲液、4 种 dNTP、Taq 酶、DNA 模板、引物 I： 5， -ATGGGCGTCTCTGCTGTT-3，引物 II：5 ， -GCTAAGCAAAACACTCCGCCC-3，实验步骤：1.在 0.2ml Eppendorf 管内配制 25l 反应体系反应物 体积/lddH2O 1710*PCR 缓冲液 2.52.5mmol/ldNTP 2.2引物 I 1.0引物 II 1.0Taq 酶 0.

20、32.按下述程序进行扩增：94。 C 预变性 5min94 。 C 变性 55s57 。 C 退火 55s72。 C 延伸 1min20s重复 - 30 次72。 C 后延伸 8min注意事项：换柜头、试剂打入液面下、PCR 仪的使用。1.引物的设计原则：引物的长度为 15-30bp 引物 GC 含量：40%-60%引物自身不能发生互补 引物特异性由 3， 端决定（3 ， 端最后的碱基为 T 5， 端决定引物扩增的长度）2.10*PCR 缓冲液中的 TrisHCl 的作用：维持溶液的碱性环境。10*PCR 缓冲液中的 KCL 的作用：有利于引物的退火，浓度不宜过高，过高会影响 Taq 酶的活性

21、。10*PCR 缓冲液中的 Mg2+的作用：Taq 的辅酶，浓度过高会影响 PCR 反应的特异性，浓度过低会影响 Taq 的活性，使反应量减小。3.dNTP 中 4 种脱氧核苷酸要等浓度。4.模板的种类：基因组 DNA、质粒 DNA、RNA 反转录的 cDNA。5.PCR 的反应体系：25l、50l、100l。6.酶单位：5 个单位/l。7.预变性的作用：使双链充分打开。8.后延伸的作用：确保 DNA 链完全延伸。实验五琼脂糖凝胶电泳检测实验目的：通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术。实验原理：DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA 分子在高于等电点

22、的 PH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不同，可进行分离 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。仪器：材料与试剂（一）仪器：琼脂糖电泳系统、紫外线投射仪（二）材料：Tris、硼酸、EDTA、核酸染料、上样缓冲液（三）1

23、0*TBE 10*TBE Tris:108g EDTA:7.44g 硼酸：55g。实验步骤：（一）制胶：称取 0.8g 琼脂糖放入三角瓶中，加入 80ml0.5*TBE 缓冲液置于电炉上加热，至完全融化，待 60。 C 加入核酸染料混匀。（二）胶板制备：1.将制胶器放入制胶槽中，并放好样品梳子。2.将冷却至 60。 C 的琼脂糖凝胶液缓缓倒入大板中，直至形成一层均匀的胶面（不要形成气泡） 。3.待胶凝后，取出梳子，将大阪放在电泳槽内。4.加入缓冲液至电泳槽中。（三）加样：用移液枪将 2l 上样缓冲液和 10lPCR 产物质粒混匀，加入加样孔。（四）电泳：1.接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 的

24、迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处停止电泳。（五）观察：将凝胶取出，放入紫外线投射仪中，观察条带。1.核酸染料是溴化乙锭的代替物，其作用是改变碱基间的距离。2.加核酸染料的凝胶在紫外下为荧光绿色。3.DNA 在凝胶过程中有 3 中形式：超螺旋结构、开环结构、线性结构凝胶后 3 中结构距胶口由近及远的顺序分别是：开环结构、线性结构、超螺旋结构。4.上样缓冲液中 40%蔗糖的作用：沉淀 DNA，使要上的样更好地进入点样口。5.上样缓冲液中 25%溴酚蓝的作用：指示剂。6.上样缓冲液：上的样品=1:57.电泳的电压要求：8.03）甘油浓

25、度过高：5% 4）酶浓度过高：1/109. 大肠杆菌感受态细胞的制备原理：细菌处于 0。 C CaCl 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细菌的表面，经 42。 C 短时间处理 2min 促进细胞吸收 DNA 复合物，将细胞放置于非选择性培养基中，保温一段时间，促进在转化过程中获得的新的表现型得以表达，以免在后续选择培养基上由于不能及时的合成新的表现型而导致转化后的细菌不能进行正常的生命活动，最后将细菌培养物涂在含有相应抗生素的选择培养基上，对细菌培养物进行抗性筛选，以获得重组细菌。10. 感受态细胞制备过程中注意安全：1)感受

26、态细胞的制备应严格无菌操作，慎防杂菌污染。试验中凡涉及溶液的移取、分装等需要敞开实验器具的操作均应在无菌台中进行操作。2）细胞最好置于-70 。 C 或-20 。 C 甘油保存的菌种直接用于制备感受态细胞的菌液。操作过程中也要保持在低温状态以使操作过程中待制备细胞处于正常状态。3）离心前制备菌液 OD 在 0.3-0.4 之间。4）倾倒离心管中的 LB 培养基时要温柔，倒扣时要保证离心管壁没有水珠，菌块要保证不滑落。5）加入 CaCl2 之后要保持低温，且要高纯度以免掺杂。6）加入 CaCl2 后所有操作都应该在冰上操作。11. Ca2+在制作感受态细胞时的作用：1）Ca 2+能破坏细菌细胞壁

27、的结构，是细胞壁和细胞膜之间的蛋白质发生缺失，形成残壁的细胞有利于转化。2）0.1mol/l 的 CaCl2 属于低渗溶液，可以改变细胞的形状，从而使细菌的细胞膨胀成球形。3）CaCl 2 能与外援 DNA 之间形成羟基-钙磷酸复合物，使其粘附在细菌细胞表面。12. 质粒 DNA 转化大肠杆菌提高转化率的方法：1）整个操作过程要在无菌条件下进行，放置杂菌污染。2）大肠杆菌细胞要始终置于冰盒中操作，热激后也要放入冰盒进行冰浴。3）大肠杆菌感受态细胞从-80 。 C 冰箱中取出要注意，置于冰中溶解降温。4）转化的高低同感受态细胞的浓度成正比。5）感受态细胞的生长状态要在对数生长期 OD600=0.

28、3-0.4。6）质粒的浓度在一定范围内同转化率呈正比，质粒浓度达到其与大肠杆菌形成羟基-钙磷酸复合物达到临界时反应有下降趋势。7）质粒加入的体积要小于总反应体积的 1/10，应以提高转化率。8）质粒加入量一般为 100ngpUC19/200l 细胞。13. -互补原理、 lacz， 基因的插入失活鉴别原理：lacz， 基因编码 - 半乳糖苷酶，基因前 146 个氨基酸称为 -多肽，它能与部分缺失 lacz， 的基因的大肠杆菌突变株进行 -互补作用，生产出完整的- 半乳糖苷酶，该酶在诱导物 IPTG 存在下底物 X-gal 相互作用后，产生蓝色产物。在 pUC8 质粒中 lacz， 基因和氨苄青

29、霉素抗性基因，其中 lacz， 基因的插入失活来进行重组体的鉴别，pUC8 质粒的大小要比 pBR322 质粒小，复制能力强。14. PCR 反应步骤：1）94 。 C 预变性 5min：为使模板变性彻底以利于 Tag-DNA 聚合酶的结合。2）高温变形：（90 。 C-95。 C 高温，30s-1min ）94 。 C 双链模板 DNA 解链形成两条单链 DNA。3）低温退火：（50 。 C-65。 C。30s-1min）退火温度是受设计引物的 Tm 值决定的，一般选择退火温度相差 1-5 度内，部分引物与模板单链 DNA 的特定互补部分想配对和结合。15. 高压灭菌锅使用注意事项：1）使用

30、前检查锅内的水是否充足 2）使用前设定好灭菌温度，压力和时间3）打开和关闭灭菌锅时应注意同时旋转对称的螺旋4）至少待灭菌物稍微冷却后方可取出16. 超净工作台使用注意事项：1）确保使用状态时紫外灯必须关闭2）保持清洁，用酒精灯擦拭台面和双手3）不要使用酒精棉擦拭有机玻璃挡板17. 高速冷冻离心机使用时要注意事项：1）事先预冷，并调节好温度，转速等2）使用前离心管必须配平3）使用后要关闭电源，擦拭干净离心机内部的水珠18. 移液器用于微量液体的移取，使用时要注意：1）使用前要看清楚量程，并在量程范围内使用2）使用时要缓慢用力3）切记避免有机溶剂腐蚀枪杆4）使用后调整至最大量程19. 凝胶电泳装置

31、的使用的注意事项：1）使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定使用电压、电流等。2）使用时要戴 PE 手套，并注意不要产生大量的污染物。20. 紫外灯投射仪及凝胶成像系统使用的注意事项：1）不要造成 EB 污染2）使用时先开电源再开紫外，关闭时相反3）使用后将凝胶及时拿走放回收处，并使仪器内部保持洁净21. 烘箱使用的注意事项：1）防止器皿水分过多，造成短路2）塑料等器皿切记不要高温烘烤3）玻璃器皿等高温烘烤后要注意及时断电，千万不能过夜22. 常见有害物质：1）苯酚、氯仿、异戊醇：蛋白质变性，溶液分层，用于 DNA 的纯化2）EB：电泳时 DNA 条带可视化3）CTAB：基因组的

32、分离提取，植物 DNA 或 RNA 的提取4）DEPC （焦乙酸二乙脂）： RNA 酶抑制剂，用于 RAN 提取时对塑料上RNase 的处理。5）放射性元素，32P 、 35S 等：分子杂交时标记探针。23. pUC19 质粒优点：1）质粒大小 2.69Kb,易于转化2）存在编码 -多肽的前 146 个氨基酸 lacz， 基因3）具有 MCS 多克隆位点，以利于酶切，以及目的基因的插入4）具有 AmPr 抗性基因，以助于重组体的鉴定5）纯在 Ori，能够自主复制6）高拷贝能达到 500-700 个 Copy，以利于目的产物的表达实验设计1. 质粒 DNA 转化大肠杆菌实验流程：1）取 200l

33、 新配制的感受态细胞加入 DNA2l ，混匀，冰上放置 30min，本实验用 pUC19 同时做两个对照管：受体对照：200l 感受态细胞+2l 无菌水质粒对照：200l，0.1mol/l CaCl 2 溶液+2 l 质粒 DNA2)将管放于 42。 C 循环水浴 90s。3）水浴 2min 后，每管加入 800l 的 LB 液体培养基，培养 45-60min。4）4l 的 IPTG 和 40l 的 X-gal 混匀：8lX-gal。5）用无菌枪头将混合液移至含有 Ampr(50g/ml)的培养皿中，再用无菌三角头玻璃涂布棒，将菌液均匀涂满整个平板表面。6）将适当体积（100l）转化的感受态细

34、胞涂在含有 Ampr(50g/mg)培养皿中。7）倒置平皿 37。 C 培养 12-16h，出现菌落，记录数据。2. 大肠杆菌质粒 DNA 的提取：1）将 2l 含有相应抗生素（Ampr50g/ml）的 LB 液体培养基加入到试管中，接种含有目的基因质粒的大肠杆菌，37 。 C 振荡培养过夜。2）取 1.5ml 培养物倒入微量离心管中，40000r/min 离心 20min。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。3）细菌沉淀悬浮于 100l 溶液 I 中充分混匀室温放置 10min。4）加 200l 现配制的溶液 II，盖紧管皿，混匀内容物，为了尽量防止 DNA变性，将离心放置冰上 5min。5）

35、加 150l 溶液 III（冰上预冷）盖紧管皿，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。6）12000rpm 离心 15min，将上清液转移至另一离心管中。7）向上清液中加入等体积氯仿/异戊醇，反复混匀， 12000rpm 离心 5min 将上清液转移出另一离心管中。8）向上清液中加入冰浴好的 2 倍体积无水乙醇和等体积 NaAC，混匀后，-20。 C 放置 15-20min，12000rpm 离心 5min，弃去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上吸干。9）用 1ml70%乙醇洗涤管里的 DNA 沉淀，振荡并离心，弃上清，真空抽干或空气中干燥。10）加 20lTE 缓冲液，其中含有 20g/ml 的

36、胰 RNA 酶 37。 C 水浴保存30min，使 DNA 完全溶解，-20 。 C 保存。3. 大肠杆菌感受态细胞的制备流程：1）用划线法将大肠杆菌 DH5 接种于无抗性固体培养基上，与 37。 C 倒置培养 1-2d。2）从菌板上挑取一个单菌落至 2l 液体培养基中， 37。 C 振荡培养过夜。3）取 0.25ml 菌液转到一个装有 25mlLB 液体培养基的锥形瓶中， 37。 C 振荡培养 2-3h。4）将菌液转移至 10ml 离心管中，冰上放置 10min。5）4 。 C 离心 10min， （4000rpm）回收细胞，弃去上清。6）倒出上清将离心管倒置 1min（以内） ，以便培养液

37、洗尽。7）用冰冷的 2ml 0.1mol/lCaCl2 溶液悬浮细胞沉淀，立即放于冰上保温30min。8）4 。 C 离心 10min（4000rpm） ，回收细胞弃去上清。9）用冰冷的 0.1mol/l CaCl20.4ml，悬浮细胞（务必放在冰上） 。10）分装细胞，200l/份，加 30l 无菌甘油混匀置-80 。 C 冰箱中保存，此细胞即为感受态细胞。4. 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA:1）制胶：称取 0.8g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入 80ml0.5*TBE 缓冲液置微波炉或水浴加热至完全融化，待 60。 C 加入核酸染料 8l 混合均匀。2）胶板的制备：将制胶器（大板）放置于制胶槽中，并放好样品梳子。将冷却至 60。 C 的琼脂糖凝胶缓缓倒入大板中，直至形成一层均匀的胶面（不要形成气泡） 。待胶凝固后，取出梳子，将大板放在电泳槽内。加入缓冲液于电泳槽中（点样孔置于负极端） 。3）点样：用移液枪 2l 上样缓冲液和 10lPCR 产物或质粒混匀，加入点样孔。4）电泳：接通电泳槽与电泳仪电源，DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过 5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处停止电泳。5）观察：将琼脂糖凝胶取出，放入紫外线投射仪中观察条带。