1、实时荧光定量反转录 PCRReal-Time Reverse Transcription PCR（RT-PCR）1 材料 1. 1 仪器756 型紫外分光光度计 国产上海ABI 7300 Real-Time PCR System 美国 ABI 公司RS-28 高速低温离心机 德国贺利氏公司超低温冰箱 德国贺利氏公司UVP 凝胶扫描系统 美国 UVP 公司微量移液器 德国 Gilson 公司DYZ-22A 型双恒定时电泳仪 北京市六一仪器厂DYY-桥式电泳仪 北京市六一仪器厂1. 2 试剂RNA 提取试剂 Trizol Reagent 为 Invitrogen 公司产品；逆转录酶（M-MLV ）
2、 ，核糖核酸酶抑制剂（RNasin） ，dNTP，Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase ） ，随机引物（ Random primers） ，琼脂糖（agarose）均为美国 Promega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI 公司RNA 提取:取约 100mg 组织于冰浴匀浆器中，加入 1ml Trizol (Invitrogen,USA)，迅速研磨成匀浆液，加入 200l 氯仿，震荡 30S，冰上放置 5 min。4，12000 rpm，离心 10 m
3、in，取上层水相转移至另一 1.5ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20静置 2h。然后 4，12000 rpm，离心 20 min，弃上清，加入 1ml 75%乙醇，轻轻混匀，4，12000 rpm，离心 10min，吸净上清液，于室温下晾干，加入 20l DEPC 处理的去离子水溶解沉淀，-80保存备用。反转录（RT）:（试剂盒: Promega，USA）反转录反应液组成如下表：Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chainComponent Volume（l） Concentration5R.T.buff
4、er* 5 1dNTP 2.5 10M/lRNasin 2 20U/lRNA 5.3 gRandom Primer 1 0.1ug/lM-MLV 6 5 U/lNucleasr-Free Water 3.2Total 2542反转录 50min，95 5min 灭活反转录酶。Syber Green 荧光定量 PCR 检测：(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI)仪器型号：ABI 7300 Real-Time PCR System, 美国 ABI 公司PCR 反应液组成如下表：Table 2 Mixed c
5、omponents for polymerase chain reactionComponent Volume （ ul）R.T.product 12Master Mix 10Primer 1+1H2O 7Total 20PCR 热循环参数：96 4min，然后三步反应：94 30S，58 30s，72 30s，进行 40 个循环，于每个循环的第三步即： 72 30s 收集荧光信号。实时荧光定量 PCR 结果分析:扩增完毕后，进入结果分析界面，以 GAPDH 为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ 值） ，将 RQ 值用于统计分析。引物序列：GAPDH 上游引物：5- TGAACGGGAAGCTCACTGG -3下游引物: 3-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC -3
