1、一、实时荧光定量 PCR 原理（一）定义：在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。（二）实时原理1、常规 PCR 技术：对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量 PCR 技术：利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线 ：（2） 荧光阈值：（3）Ct 值： CT
2、值的重现性：5、定量原理：理想的 PCR 反应： X=X0*2n非理想的 PCR 反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第 n 次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的 C(t)值推算出其初始量7、DNA 的荧光标记：二、实时荧光定量 PCR 的几种方法介绍方法一：SYBR Green 法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链 DNA 的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光3、变性时，DNA 双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链 DNA
3、， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR 反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制 Taq 酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2 、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3 、MgCl2 的浓度:可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物4 、反应 Buffer 体系的优化5 、反应温度和时间参数 :由酶和引物决定6、其他与常规 PCR 相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2 、 基因型的分析；3 、 融解曲线分析：可以优化 PCR 反应的条件，对常规 PCR 有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体
4、、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对 DNA 模板没有选择性；适用于任何 DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏； 便宜。缺点：容易与非特异性双链 DNA 结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件； 对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan-水解型杂交探针*5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如 FAM、VIC 等 *3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)* 探针完整， R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收 ，无荧光， R 与 Q 分开，发荧光*Taq 酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条 DNA 分子
5、，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR 反应的建立：1、引物、探针的设计：探针 Tm 为 68-70 ，30 bp, 5不能有 G，G 可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物 Tm 为 59-602、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq 酶 53外切核酸酶活性在 60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小 Ct 值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规 PCR 相同（二）优缺点优点：对目标序列的高特异性-阴性结果确定设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标;委托公司标记，价格较高;不易找到本底低的探针
