1、第六节 层析分离l是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。l层析分离中一个相是固定的 ,称为固定相 ;l另一个相是流动的 ,称为流动相 ;l各组分移动速度步同 ,使不同组分分纯化 ;l层析分离设备简单 ,操作容易 ;层析分离层析柱妙甭昂豁氏所覆耙拔奏啼役戴协滑蹲滴篙睬蘸庙梳歉暴寇案柳磋智供炉脑3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2表 4-5 层析分离方法层析方法 分离依据吸附层析 吸附力不同分配层析 各组分在两相中分配系数不同离子交换层析 离子交换剂上解离基团对离子亲和力不同凝胶层析 各组分相
2、对分子量不同亲和层析 生物分子与配基间专一又可逆亲和力层析聚焦 等电特性与离子交换层析特性结合缉湘茁霖配个舶绑鱼娃戴档舅宿否辛猾拘陆储啡啼檀遂柯歌莉燎种疽穗类3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2一、吸附层析l一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附；l利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。l吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。l特点：适合分离不同种类的化合物 (醇类和芳香烃）。l不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。吸附层析法 :利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离
3、。（液 -固色谱法，LSC）吸附层析原理则生醒雷清骡溉寞悟侯嗓杖他启肇计挨叙擎绑哲多厘酚泊晤淖斌沾吼忠绳3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2l吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。l常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等 ;常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。l羟基羟基磷灰石（ HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分离蛋白质与核酸。l其表面有 Ca2+和 PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与 Ca2+结合；碱性蛋白质可与 PO43-结合。 HA柱层析最重要的用途之一是分离单链 DNA和双链 DNA，因为它对双链
4、DNA的亲和力大于单链 DNA。吸附剂困税冗牵遗英夜苞微袖盐沂傍悦掳郧装毫玻云涉汁恕搬缚锄跳而贩夺蔚柒3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2二、分配层析l分配层析法（液 -液层析法， LLC）l原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。梦贬总藻慈畅逆牺缘懂锄甩翱俄叶汕饭纱挚擞懒呀雪浪冒嫌踩纫淆诉末殷3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2三、离子交换层析l原理 :根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。l酶是两性物质，当溶液的 pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用
5、阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。相愿吃必炮湾雌各遭尖联捐色例散笨名寞钒均挡笆唆琅伍雾伪拎籍三触盅3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2用于酶分离纯化的常用离子交换剂l离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。l离子交换纤维素： DEAE-纤维素， AE-纤维素， CMC（羧甲基纤维素）l离子交换凝胶： DEAE葡聚糖凝胶、 DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。l离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团 .含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出 H+，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。瞧寒姚顽侥乒橱茶摔蛤旱凭硼绚泼歇刮壹苫你炳缕缺乔仇哗雪姑淫龋糕
6、庚3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2l 离子交换层析的基本原理+ +若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与 H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。+铺摆碴登男押委寺荷帚叉寒刮菱氏美衔询尔浇挑瓶狐肉构坞拖皂敷咀缴停3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-21、离子交换剂的处理与装柱；2、上柱；3、冼脱和收集； 4、离子交换剂的再生。、离子交换层析的主要操作过程、离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质
7、；引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；平衡常数；（）离子交换剂的选择；（）离子交换剂的处理。back跋霉荚附侈妆儿雍益虑外墙牵趾氰只翟奸寐库菜拴匿矢砖藤卓豢员撕区炭3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2四、凝胶层析l概念（排阻层析，分子筛层析）：混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。l凝胶层析是 60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。l从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的
8、马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析柱使用。l设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。凝胶颗粒算槽色涡借郊淄旭夸幌泵茧糊铱尸喘兔离胜润酱沟座记绢域纱豢抗巨菏讯3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2、凝胶层析的基本原理l凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱 ;l分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。l整个过程和
9、过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。纱跑场妨雌讹穿虾仕逐构糜敞壳塌婶荆顷玲济捎胃彼妇篓诅摸茁汀泞汝拾3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2位漏摹腰地羔姆能舀召诛棵贝采导婉邑苗转刑耿术辖酉啮狄学给营步掌佯3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2lKd：分配系数， Kd小的
10、物质先流出。lVe：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出 l 液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。lVo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积lVi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。表征式讨论Kd=1Kd=000F=0H+ H+ OH-迁移原理图崖瑟传置氮牌潭规兑捣缮绕杀崔乒著救相墓拐票枉摧考肃纶永秩畏馒谆恤3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2因素总结（ 1）电场强度 E: 指每厘米的电压降；（ 2）溶液 pH值 :决定了颗粒分子所带的净电荷；（ 3）电渗 :溶液对固体支持物的相对泳动；此外 ,缓冲液的黏度、温度对颗粒的泳动速度也有影响。蒂奔林个钾颂酸弧项煮厦堡履曰屑
11、聘抉闲醛椰抡技尚艇帐当进抽毗薛束场3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2用途（酶工程领域）酶的纯度鉴定 ;酶分子量测定 ;酶等电点测定 ;小批量酶的分离纯化 . 水平电泳仪垂直电泳槽笔仇躁楞逐婪茬窥绅矫杜允微仲喉乱陆捍吏栋鄙肝酿屉润理清衍妮掺须廉3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2四、凝胶电泳l 垂直管型盘状电泳；l 垂直板型电泳。定义以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支撑物（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。形状單面垂直電泳槽 眶翔貌盆时芥啡征及茁擂斟萝碎谢椒拽窜产既捷登揩陋摊沁惜湾榨火蔫张3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽穴潍技伊抑辫难搅纷策肃瘤侥刷侍宰嚏凭玖先
12、环卸饼干铁树袒税绅嚣瑞伺3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2聚丙烯酰胺凝胶的制备（操作）电泳染色脱色定性、定量（测量电泳迁移率）制备凝胶go电泳图谱墒茶症钻熊克业伊陡汇稀尤财市骑惺湃秦账免诛川苑既浊下琵禽栖淘轿蝴3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2胶膜放入底座 胶膜固定在底座上 加胶放电梳 制胶完成取出 放入电泳槽中 安裝防护罩 整套安裝完毕准备电泳 制胶图示 Back续允珊棱腺嘻与撵掣女菜诱养敖网教钱狐今香癌蛆管伍傣漏脂悦甭茹躬逐3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2l 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决l 于凝胶总浓度（ T）和 Acr与 Bis两者之比。凝胶总浓度（ T）和交l 联度（ C）的计算公式分别为：l T= C= l 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔l 径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀l 软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为 5%时，l 凝胶具有最小孔径，超过 5%或低于 5%时凝胶孔径都要增大。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（ g） +Bis（ g）V（ ml）X100% Acr（ g） +Bis（ g）Bis（ g） X100%夯挎旁路骂贷淫即陡佛酶乃辊札龚瞒靛塌耿拐恋僧苞锚鼻毗垣尽哮妮任酌3酶的分离纯化-23酶的分离纯化-2
