1、第二章 酶的分离纯化,第二章 酶的分离纯化,知识点: 1.酶活性测定 2.酶溶液制备 3.酶分离纯化的基本过程 4.根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 5.调节溶解度的分离方法 6.按电荷的正负性设计的分离方法 7.根据亲和作用建立的纯化方法 8.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 9.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法,学习目标和要求: 1.掌握酶活性测定和酶溶液制备方法. 2.掌握根据分子大小轻重建立的分离纯化方法和按电荷的正负性设 计的分离方法及.根据亲和作用建立的纯化方法 3.熟悉酶分离纯化的基本过程 4. 了解调节溶解度的分离方法、根据亲和作用建立的纯化方法、.根据稳定性的差异建立
2、的分离纯化方法及.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法,酶的分离提纯包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题: (1)要注意防止酶的变性失活. (2)酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。,(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去
3、脉，为选择适当方法和条件提供 直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。,1 酶活性测定,酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，履指酶催化一定化学反应的能力.酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示.其单位为mol/s。 1.1 酶的活力单位 1.2 摩尔催化活性分子活性和转化率(催化中心活力),mol催化活性(Molar Cata
4、lytic Activity)表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：Vmax=KoE Ko=Vmax/E Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n. 每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:,1.3比活力比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一 般来说，酶的比活力越高，酶越纯. 1.4酶活力的测定方法酶活力与底物浓度、酶浓度、
5、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 1.4.1终止反应法(Stopped Method) 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。,（1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖+O2葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内
6、脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:,由于4甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只要测定A435，就可知4甲氧联酚的量，可得H202的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5倍以上。,偶联法中偶联酶对反应速度的影响,再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖ATP葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P+NADP+ 6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+ 这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性. 酶偶联测定法可用分开的也可
7、用连续的反应系统进行. (2)化学法化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性.,化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、
8、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。 （3）放射性化学法是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性.,优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。 缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 1.4.2 连续反应法(Continuous Method) 连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积
9、、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：,（2）偶联的连续法是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的
10、酶活力。如醛缩酶(Aldolase)催化1，6二磷酸果糖生成3-P甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出.用磷酸丙糖异构酶(Triose Phosphate lsomerase)来作偶联酶(Coupling Enzyme)， 甘油1P脱氢酶(Glycerol-1-Phosphate Dehydrogenase)来作指示酶依据NNADH变成NAD+的光谱变化来算出醛缩酶活性。 如下图：,醛缩酶以lP甘油脱氢酶 为指示酶的偶联测定酶活性法,1.4.3酶活力测定中应注意的几个问题酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样
11、一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的些特点。首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比.初速度的确定一般指：底物消耗量在5以内，或产物形成量占总产物量的15以下时的速度。其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱和)，否则，底物浓度本身是个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。第三，反应必须在酶的最适条件(如最适温度、PH和离子强度等)下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度( E)作图，应得一条通过原点的直线，即v为（E）的线性函数。,初速度
12、的确定是在底物浓度(S)足够的条件下，通过E的变化来确定 如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化.求得几个适当时间的反应速度(反应量反应时间)。再用反应速度对酶量作图 。由图可见其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。,1.4.4酶活性测定实例 (1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶,催化反应为:O2 +O2+2H+H2O2+O2 由于O2 在溶液中极不稳定,给酶活性测定带来许多不便. 目前已有根据O2的物理性质测定O2的歧化量,从而直接测定SOD活力的方法.如电子顺磁共振波谱法(ES
13、R)、核磁共振法（NMR）、紫外分光光度法等，这里只介绍化学法测定酶活力。以邻苯三酚法为例：邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实验条件下（见操作），抑制率达到50%时的SOD的浓度为1个酶单位。,操作方法：在试管中加入pH8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液4.5ml，于25保温20min，然后加入预热的45mmol/L连苯三酚溶液（对照管用10mol/L HCl代替）10l，迅速迅速摇匀倒入1cm比色杯，每隔30s在325nm处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚
14、的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在0.070OD/min。测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同的仅是在加入缓冲液后再加入10 l待测样品即可。酶活力计算方法： 单位体积活力（u/ml）= （0.07样品速率）/0.07 100%）/50%反应液 总体积（反应液稀释倍数/样液体积） 总活力=单位体积活力（u/ml） 原液总体积 用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有10ul，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。,(2)糖苷酶的活力测定糖苷酶的活力测定多用人工底物,如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下,糖苷键断裂,产生等当量的糖和对硝基
15、苯酚.对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收.从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性. 操作:试管中加入5mmol/L对硝基苯基糖苷200ul,pH4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸配制的缓冲液200ul,37预保温10min,再加入ul待测样品并用水补足到100ul,37 反应15min,用0.5mol/L Na2CO31ml终止反应9注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品),在400nm处测定A值.酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放1umol对硝基苯酚的量为1个单位的酶,对照标准曲线,即可计算处酶活力.,2 酶溶液制备 酶溶液制备包
16、括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。 2.1材料预处理及破碎细胞酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：是释放到细胞外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶叫溶酶；三是牢固与膜或细胞颗粒结合在起的，叫结酶，后二者合称胞内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。微生物胞外酶，用盐析，或单宁沉淀.有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取，其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞，也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳以免单宁等物质着色污染。 进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化
17、学方法两大类:,2.1.1物理粉碎法 (1)研磨 手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞 抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在实验室中使用较好的方法。 (2)机械捣碎 匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎. (3)高压法 在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在215下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。 (4)爆破性减压法 将菌体悬浮在N2C02高压下平衡，37振荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎. (5)专用波振荡 专用波振动通过液体时形成局部减压，
18、叫空化作用，旋涡生成与消 失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。 (6 )快速冰冻融化法 由于突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内外浓度突然改变，可使某些细胞破碎。,2.1.2 化学法 (1)渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净并悬于含蔗糖、EDTA的稀的 Tris缓冲液中，待平衡后，离心，加入MgC12剧烈搅拌，可使某些水解酶从细胞内释放出来. ( 2)干燥处理 干燥方法可用空气干燥、真空干燥、冷冻以及脱水干燥。如空气干燥，一般在2530 或高到3540的气流中吹干，然后将干菌体悬浮于35倍的水中或缓冲液中，室温搅拌23h抽提。 (3)自溶 向菌体中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使细胞渗透性改
19、变，保温一定 时间后，可以使菌体自溶。 (4)溶菌酶处理 用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上多糖分子的1，4糖苷键，从而破坏细胞壁. (5)酶处理 作用于细胞壁的酶有白细胞酶、溶菌酶等，用以处理细胞，使酶释放出来。,(6)表面活性剂处理 膜结合酶在细胞破碎后很难溶解下来，常借助表面活性剂来解决。在适当PH及离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解. (7)其他 如当细菌感染噬菌体后，噬菌体附着于菌体细胞壁，导致菌体自溶等. 2.2 抽提由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。 抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、
20、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。 2.2.1pH 选用pH，首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的PH稳定范围o其 次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出发，选用pH 46为佳。,2.2.2盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液, 0.15mol/L NaCl等。焦磷酸 钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物质的联系,也常用.据报道，少数情况下用
21、水抽提亦佳,这可能与低渗破坏细胞结构有关. 2.2.3温度 温度通常控制在0一4左右.如果酶比较稳定时，可以例外。如胃蛋白 酶可在37F保温抽提。 2.2.4抽提液用量 抽提液用量常采用原料量的15倍。有时，为了抽提效果好些需 要反复抽提时抽提溶液比例可能大些. 2.2.5其他 在细胞破碎以后，某些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提系统带来不稳定的因素，因此有时还要加入一些物质。例如：加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白酶破坏目的酶；为防止氧化，加入Lys或维生素C、惰性蛋白及底物等。,总之，打破细胞后，溶酶一般不难抽提。至于结和酶，其中有些和颗粒结合不太紧，在颗粒结构受损伤时，抽提也不难。例如：酮戊二酸
22、脱氢酶、延胡索酸酶，可用缓冲液抽提出来；CytC可用0145mol/L的三氯乙酸溶液抽提出来。那些和颗粒结合紧密的酶，常以脂蛋白络合物形式存在，其中有的在作成丙酮粉以后，就可以抽提出，有的却要使用强烈的手段，如正丁醇等处理。正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性(特别是磷酸盐)，能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。近年来，广泛采用表面活性剂，如胆脂酸盐、 Triton、Tween、Teepol、十二 烷基磺酸钠等，抽提呼吸链酶系。链霉菌葡萄糖异构酶的抽提，向菌体悬浮液中加入01十二烷基吡啶氯化铵酶的抽出率提高到8倍等(下表).此外，有时使用促溶剂如高氯酸。有时还用酶处理，如脂肪酶、核酸酶、
23、蛋白酶等。,表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果的影晌,抽提后的细胞残渣或固体成分可用离心或过滤除上，在离心时，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙等物质，有助于除去悬浮的胶体物质。,2.3酶溶液的净化与脱色在酶的抽提液或发酵液中常含有细胞、细胞碎片等固形物质和蛋白质、粘多糖、脂类和核酸等大分子物质，通常应通过离心或过滤而净化。由于发酵液浓度较大细胞颗粒微小(细菌细胞只有1一l0um)，相对密度只有1.03,有些细菌细胞表面带负电荷与发酵胶液流动电位电荷相互排斥；由于细胞壁外层的多搪、蛋白质等生物大分子与水结合成水化层而形成疏水强的稳定颗粒，这些在生产上为酶溶液的离心或过滤净化处理带来困难。通常需要使用絮凝剂
24、后才能净化。 一些絮凝处理如表:,絮凝剂种类分为无机的、有机的和天然高分子多种。无机絮凝剂：有些无机絮凝剂如铅盐、铁盐等水解后生成氢氧化物的凝胶微粒具有吸附作用和电荷作用，产生絮凝下降。有些无机絮凝剂如醋酸钙、磷酸钙等钙盐及锌盐也具有包围吸附沉淀作用.有机絮凝剂是一些聚合物，多为水溶性直链状的大分子，按其链上所带基团不同而分为阳离子型、阴离子型和非离子型三种。其中以聚丙烯酰胺使用最广泛，也有用阴离子型和非离子型的絮凝剂。天然高分子絮凝剂主要有壳聚糖。壳聚糖与钙盐或铝盐可增进分离效果。,有些工业上用酶还需要脱色。但需考虑：在酶的提取分离过程中的什么阶段进行脱色处理，使脱色工作量最少，又不由于脱色
25、操作而引入杂质。工业上常用的脱色剂是活性炭。活性炭吸附色素而脱色。活性炭的用量、处理时间、温度等对脱色效果和酶的回收有影响。另外，不同方法制得活性炭吸附能力也不同。吸附能力强的活性炭，对酶的吸附能力也强。用氯化锌法制得的活性炭，吸附能力强，而水蒸气法制备的活性炭的吸附能力弱，但同时可以除臭。活性炭的用量一般为01一15，根据色素的多少而增减。 一般由于活性炭颗粒较小，采用静态吸附法进行脱色。,只外，离子交换树脂也用于脱色。其中，大孔径的树脂效果较好.但在吸附色素的同时，会引起脱色液pH和离子强度的变化，必须对树脂进行缓冲化，使之与酶溶液的pH和离子强度一致。采用无离子交换作用的专用于脱色的树脂
26、如Duolite S30、通用l号等进行脱色，对某些酶液的效果较好.通用1号脱色树脂在PH5.5以下吸附色素，而在5碱液中脱出色素，脱出色素后用水冲至中性，再用两倍树脂体积的5盐酸溶液处理，最后用水洗至pH5.5以下可再生利用.不同材料来源的酶溶液中加人不同的脱色剂，可以减少色素。例如：从植物材料提取酶时，常加人05一1的吡咯烷酮，在枯草杆菌淀粉酶和蛋白酶盐析时，加入亚硫酸盐(Na2SO3、NaHSO3等)都可以除去部分色素.,2.4 浓缩提取液或发酵液的酶蛋白浓度一 般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1一1.因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法
27、、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段(我们将在下节中介绍)再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。 2.4.1冷冻干燥法 将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。采用这种方法能使多种酶活性长期保存。但操作需注意几个问题：首先被冻的最好是酶的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时样品融化而起泡导致酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化，例如：PH 7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将酶溶液
28、脱盐。,依据溶液相对纯水熔点升高，冰点下降原理，对少量样品，一是将溶液冻成冰，然后缓慢溶解，这样冰块(不含酶)就浮于表面，酶溶解并集中于下层溶液(约为原体积的1/4)；二是让酶溶液慢慢冻结后移去水结成的冰。这种方法也会发生离于强度和pH的变化。 2.4.2蒸发法通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩 的酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。,2.4.
29、3超过滤 超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用.这种方法具有下列优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下操作等，因此，近年来发展很快。超滤膜主要有以下几种类型： (1)平面膜 将膜平铺在多孔支持板上，加压下(可带有搅拌)酶溶液从膜面流过水及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子(如酶)被截留.,(2)管式膜 将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水和分子溶质透过越滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。 (3)中空纤
30、维 将聚砜作成中空纤维膜，成束中空纤维装在圆筒真空超滤器中. 2.4.4胶过滤 利用Sephadex G-250或G50等吸叹水膨胀，酶被排阻在胶外面的原理而进行浓缩。 2.4.5其他 如利用聚乙二醇等浓缩，只适用于小量样品。,3 酶分离纯化的基本过程,3.1酶分离纯化方法的选择在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质。其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质。核酸及其相关蛋白可以用硫酸鱼 精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2预先沉淀，离心除去、必要时，可用核酸酶。根
31、据不同材料选择不同的试剂。比如：从植物组织中提取乙醇酸氧化酶可在提取液中0.1-0.2硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形成复合物而沉淀，然后在4采用10 500r/min离心而除去.至于粘多糖，常用醋酸铅、乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白，因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。,酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，根据这些差异.其分离方法可有：(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。(2)根据溶解度大小分离的
32、方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等.,在实践工作中选择方法时:首先应对被纯化的酶的理化性质(如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等)有个比较全面的了解，这样，就可以知道在分离纯化时可以选用那些方法和条件，避免哪些处理，从而得到好的纯化效果;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶活性为标准。 一个好的方法和条件是比活力提高得多，总活力回收多，而
33、从重复件好;在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件。因为这样不能使纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降。再者要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降,酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。,3.2 酶分离纯化过程中一些数据的处理在酶的分离纯化过程中每步都须做三件事：第一，测定酶活力(IU/m1)；第二，测定蛋白质含量(mg/m1)；第三，测量体积(m1)。将测得数据加以整理.例如对番麻(Agave americana)蛋白酶的分离纯化，主要步骤为：叶片经30乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉，经Sephadex G50柱层析和SPSep
34、hadex C50纯化，获得结晶。纯化结果如表下表:,3.3 结晶结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。 3.3.1结晶的基本原理结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶质分子开始结晶作用，平衡状态的热力学和动力学参数决定于溶剂和溶质的理化特性。当溶液处于过饱和状态时，分子间的分散或排斥作用小于分子间的相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶，由于溶液的过饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足
35、，溶质分子相互接触机会增加而聚集.但是,当溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢地达到过饱和点溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。所以，在操作上必须注意：第，耍调整溶液，使之缓慢地趋向于过饱和点；第二，调整溶液的性质和环境条件使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。,3.3.2结晶条件 酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中的特性也变得复杂,影响其最小溶解度的因素也很多，如电解质的浓度、酶蛋白的浓度、pH、温度等因素；而且,由于常常出现几个最小溶解度，会产生结晶的多形性，从而使结晶条件也十分复杂；这样，每种酶蛋白的结晶条件也往往不同。为了获得某
36、种酶蛋白的结晶，往往需要进行一些适当的预备实验摸索. (1)酶的纯度 般来说，酶越纯，越容易获得结晶，长成单晶的可能性也越大。除个别情况外，一般酶纯度应达到50以上. (2)酶蛋白的浓度 对大多数酶来说，蛋白质浓度在350mg/ml较好。一般来说,酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，但是酶蛋白浓度过高,往往形成沉淀;酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。,(3)晶种 有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶.在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种开始溶解，还要追加沉淀剂直到晶种不溶解为止.当达到晶种不溶解又没有无定形物形成时，静置，使进晶体生长。 (4)温度 结晶温度，
37、一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活.从现有资料来看，一般控制在0一4范围内，通常在4 下。低温条件对酶不仅溶解度降低，而且酶不易变性。 (5)pH pH是酶结晶的一个重要条件有时只相差0.2pH单位时，只能得到沉淀，而得不到结晶，所选择pH应在酶的稳定范围内，般选择在被结晶酶的pI值附近。,(6)金属离子 许多金属能引起或有助于酶的结品。不同酶选用不同金属离子.在酶结晶过程中常用Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等金属离子。在许多情况下，这些离子是酶表现活力所必滞的，它们能保持酶分子结构上的一
38、些特点. (7)其他 除上述因素外，还有一些因素会影响结晶的形成。比如：需防霉，在结晶过程中不得有微生物生长，一般在高盐浓度或有乙醇时，可以防止微生物生长在低离子强度的蛋白质溶液中，易生长细菌和霉菌。为此，所有溶液需用超滤膜或细菌漏斗过滤，加入少量的甲苯、氯仿或吡啶，可以有效地防止微生物的生长。又如在结晶过程中，一般要防止蛋白酶的水解作用。蛋白酶水解作用常引起结晶的微观不均一性，影响结晶的生成和生长。,3.3.3结晶的方法 (1)盐析法 采用一些中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化钙、硝酸铵、甲酸钠等，在适当条件下保持酶的稳定性，慢慢改变盐浓
39、度进行结晶。其中，最常用的是硫酸铵、硫酸钠。一般是将盐加入到比较浓的酶溶液中至溶液呈浑浊为止，然后放置，并缓慢增加盐浓度。 (2)有机溶剂法 酶溶液中滴加某些有机溶剂，如：乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、乙睛、二氧杂环己环、异丙醇、二甲基亚砜等，也能使酶形成结晶。 一般在含有少量无机盐和适宜的pH条件下，于冰浴中缓慢滴入有机溶剂，并不断搅拌，当酶溶液微浑浊时在冰箱中放置几小时后便有可能获得结晶。,(3)微量蒸发扩散法 将纯酶溶液装入透析袋，用聚乙二醇吸水浓缩至蛋白质含量为1mg/m1左右，然后加入饱和硫酸铵溶液到10饱和度左右，再将其分装于比色瓷板的小孔内，连同饱和硫酸铵溶液放入密封的干燥器内，再在4
40、下静候结晶。 (4)透析平衡法 透析平衡法是将酶溶液装入透析袋中，对一定的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，酶溶液可缓慢达到饱和而析出结晶。 (5)等电点法 酶蛋白在其等电点时溶解度最小，通过改变酶溶液的pH可以缓慢地达到过饱和而析出酶蛋白结晶。 (6)其他方法 还有气相扩散法、复合结晶法、温度诱导法等。,3.4酶的制剂与保存酶制剂通常有下列四种剂型： 3.4.1液体配制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后不再纯化而直接制成或加以浓缩而成。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业。 3.4.2固体配制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初
41、步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高. 3.4.3纯配制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶，还必须除去热源。热源属于糖蛋白，分子量在10万以上，是染菌后细菌分泌出来的类毒素。带有这类物质的制剂注射到体内后引起体温升高。热原耐热耐酸但不耐碱，对氧化剂敏感。它可用吸附、亲和层析、改变分离纯化等方法除去。,3.4.4固定化酶制剂 具体内容详见酶固定化 3.4.5提高酶的稳定性。延长保存期 (1)影响酶稳定性的因素温度。在低温条件下(04)
42、使用、处理和保存。有的需更低温度，加入甘油或多元醇有保护作用。pH与缓冲液。pH应在酶的PH稳定范围内，采用缓冲液保存。酶蛋白浓度。一般酶浓度高较稳定，低浓度时易于解离、吸附或发生表面变性失效。氧。有些酶易于氧化而失活。,(2)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂(1)底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。(2)对巯基酶可加入SH保护剂。如巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT（二硫苏糖醇)等。,(3)其他如Ca2+能保护淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶Cl能稳定透明质酸酶。它们的作用机制可能是防止酶蛋白肽链延展。其次是表面活性剂如许多
43、酶配置于1的苯烷水溶液中，即使在室温下催化活力也能维持相当长时间。再次是高分子化合物，如血清蛋白、多元醇等，特别是甘油和蔗糖是近年来低温保存添加剂。此外，在某些情况下丙醇、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。为了防止微生物污染酶制剂，加入定浓度的甲苯、苯甲酸和百里醇等. 4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 4.1 透析与超过滤透析(Dialysis)是利用蛋白质不能通过半透膜,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开,将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋中，放入蒸馏水或缓冲液中，,小分子物质借扩散进人 透析袋外的蒸馏水或缓 冲液中。这样通过更换 透析袋外液，使透析袋 内的小分子物质降至
44、最 低。如右图。超过滤(Ultrafiltration)是利用压力或离心力强行使溶质按分子量、形状、大小的差异，所需溶质分子阻留在膜的一则，而小分子溶质则随溶剂透过膜压到另一侧，这样使大小溶质分子得到分开。所以它的持点是利用有选择透过的多微孔膜，在液压作用下，分离出大分子溶质（下图）。,超滤装置示意图,实验室内常用的超滤装置有以下几种： (1)中空纤维超滤器 中空纤维超滤装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时， 将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面
45、积大，超滤流量大、阻留溶质的浓度范围(4一20左右) 如下图。,a超滤过程 b浓缩透析仪,（2）封闭式超滤装置 封闭式超滤装置有搅拌和不带搅拌的两种。搅拌型超滤器带有磁力搅拌或机械振动，借助搅拌或振动造成高液流从而控制浓度极性.溶质浓度般为5%（图）无搅拌型超滤器也有多种形式，如用惰性气体推动柱塞迫使溶液过滤的叶柱塞推进式加压超滤器(图b)由于它无搅拌，没有控制浓度极化，而只能处理小体积的溶液,溶质浓度1%.,（）循环型超滤器 这种超滤装置浓缩大溶质的浓度可达40，同时，可用于大溶质的分离。这是种带有浅道的超滤装置。它使液体在浅道中奔流，从而使其具高剪切力稳定的层流，将浓度极化下降到最低,.离
46、心分离 在高速离心(20 000r/min)或超高速离心(80 000r/min)的力场下，酶及其他大分子发生沉降。由于各种大分子的形状大小和质量轻重不同，其沉降速度亦不同。颗粒沉降的速度决定于应用的离心加速度(ac)。ac决定于转子的速度(弧度1/S，W)与半径(cm，r)：ac=W2r 转子转了一圈等于2弧度，角速度应为:W2 n/60 n为每分钟转子的转数代入上式 得： ac4 2n2 r/3600 若用相对离心力R.C.FXg表示(g为重力加速度,980cm/s2)R.C.F 4 2n2 r/3600 980R.C.F11.18 10-6n2r 若已知半径及转速，可求得相对离心力(右图
47、),离心机轴半径 示意图,颗粒的沉降速度不仅取决于应用的离心力的大小，而且，还取决于颗粒的密度()、半径(r)和溶液的密度(o)与黏度(g/cm.s)。这样颗粒下降至管底的时间(t)为：,Xt为液面的轴半径距离(cm)，Xb为器底的轴半径距离(cm),依上述，不同大小球状颗粒下降至器底时间不同，有先有后，一般重量大的沉降速度亦大，体积大的沉降速度小，这样按照分子大小、轻重可将酶分离出来。离心分离只能把各种下降物或不溶物与溶液分开，无法把分子量、性质、结构相近的大分子细分，但内于其容量大、需时短，在分离酶时常用到.,4.3凝胶过滤 凝胶过滤(Gelfitration)即凝胶过滤层析(Gelfit
48、ration Chromatography)，也称分子排阻层析(Molecular-Exclusion)、分子筛层析(Moleculai-Sieve Chromatography)，是根据分子大小分离纯化酶最有效的方法之一(下图)。在层析柱中填充分子筛(凝胶)介质，加入待纯化样品，然后用适当缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律，其运动轨迹“迂回曲折”。因此，下移速度慢。所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依次流出，彼此分开。,为使胶过滤达到理
49、想效果，需考虑如下因素： 4.3.1凝胶选择 最常用的凝胶有以下几种：(1)葡聚糖凝胶 是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从l 000500000的分子。其商品名是Sephadex G，有各种型号(下表)，G后的数字表示每g干胶吸水量(即吸水值)的10倍。其特性如下表所示.另外还有一种为Sephacyl-S,通过N，N甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统。另一类Sephadex-LH，适用于脂类化合物的分离。,(2)聚丙烯酰胺凝胶 是以丙烯酰胺为单体通过N，N甲又双丙烯酰胺为交联剂共聚而成的凝胶物质。商品名是Bio-GelP，有各种型号、P-后的数字乘以1000表示其分离的最大分子量(即排阻分子量)。其特性如下表 所示。,(3)琼脂糖凝胶 琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得D半乳糖和3，6脱水半乳糖，自动缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定以商品Sepharose为例，有2B、4B和6B等规格，B前面数字表示胶百分浓度。这类凝胶孔径都比较大，适于分离较大的物质如病毒、细胞颗粒和DNA等。其持性如下表。另一类为SepharoseCL，适用于有机溶剂和氢键解离试剂存在的情况。还有一种称Dio-GelA是琼脂糖和丙烯酰胺的交联胶，而且有较一致孔径，可用于酶分离。,
