1、第三章、天然产物的分离与精制,目的和要求： 1、掌握初步分离纯化的方法和特点 2、掌握精细分离纯化的方法和特点 3、根据不同的提取液采用相应的分离纯化方法 4、能通过文献的查阅，自行设计提取分离路线,重点： 1、掌握初步分离纯化的方法和特点 2、掌握精细分离纯化的方法和特点,难点： 1、根据不同的提取液采用相应的分离纯化方法 2、能通过文献的查阅，自行设计提取分离路线,1、冷却、过滤 浓缩后过滤、冷却、过滤 特点：适应于溶解度对温度敏感的物质，操作容易，成本低，一般用于杂质的去除,2、改变溶剂极性（通常浓缩到一定程度后进行） 水提醇沉法（多糖、蛋白质等水溶性物质沉淀） 醇提水沉法（除树脂、叶绿
2、素等水不溶性杂质） 醇提醚沉法或醇提丙酮沉法（使苷类成分沉淀，而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中）。 特点：效果明显，但分离不够完全；需考虑溶剂的回收问题；若是用乙醇溶液提取，则浓缩到一定程度，树脂、叶绿素等水不溶性杂质会析出,一 、初步分离方法,3、改变水溶液pH值 酸提碱沉法，碱提酸沉法,等电点法 特点：用于酸性、碱性物质及蛋白质，操作成本很低，需考虑pH值对产品的影响，对于极性大的物质沉淀不完全,例： 芦丁的提取 槐米加约6倍水，煮沸，在搅拌的条件下缓缓加入石灰乳至pH8-9，在此条件下微沸20-30min，趁热抽虑，在60-70的条件下，用浓盐酸将滤液调至pH5，静置24小时，抽虑，水洗
3、沉淀至中性，得初品。,4、添加沉淀剂 酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀等析出。如下表：,要求：对所需成分，沉淀应是可逆的，并且不能有重金属残留。 特点：沉淀比较完全，但需通过特殊的方法使其恢复，有重金属残留,普通盐析：氯化钠、硫酸铵、氯化钾、硫酸钠、硫酸镁 特点：可逆，但沉淀效果不是很好,例1： 见书P62：益母草碱的纯化,例2： 三颗针根粉用稀酸浸泡，稀酸液加氯化钠近饱和即析出小檗碱盐酸盐,5、结晶及重结晶法 初步纯化阶段只适用于目的组分含量很高的情况,6、浸膏（浓缩液）分别用极性从小到大的溶剂萃取,（1）原理：相似相溶 （2）影响因素：分配系数 （3）特点
4、： 需多次萃取，且不完全 有利于后续分离及活性跟踪,（4）各种萃取方法：, 简单萃取：利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。 逆流分配法（CCD）：又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。 微分萃取 P46 液滴逆流分配法（DCCC）：本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小，并要有一定的设备，操作较繁琐。 其它 P47,（5）注意事项 萃取剂用量 乳化,7、pH梯度萃取,原理：带电荷分子（离子）极性大，易溶于水，在极性有机溶剂中的溶解度减少，难溶于弱极性及非极性有机溶剂。中性分子则相反。,8
5、、利用离子交换剂对水提取物进行粗分（可不经过浓缩）,（1）基本原理 1）离子交换剂的组成 高分子聚合物基质：高聚物，惰性，水不溶性，作为骨架，如苯乙烯和二乙烯苯共聚物 电荷基团：与骨架通过共价键连接，不能移动 平衡离子（反离子）：结合于电荷基团上的相反离子，可与溶液中的荷电同离子可逆交换,2）结构特点 多孔弹性颗粒,3）离子交换色谱定义 离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)：利用离子交换剂作为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的方法。,（2）离子交换剂的分类及选择 1）按骨架分类 合成树脂骨架的多孔弹性颗粒 苯乙烯衍生
6、物、苯乙烯和二乙烯苯共聚，树脂颗粒孔径小，机械强度大，可承受高的流速，易引起蛋白质的变性，常用于分离小分子,多糖类骨架的离子交换树脂经多糖羟基化学修饰而来，如纤维素、葡聚糖、琼脂糖，机械强度小，用于蛋白质等亲水性物质的分离,2）按反离子分类 阳离子交换剂：强酸型、中等酸型、若酸型 阴离子交换剂：强碱型、中等碱型、若碱型,3）离子交换发生的趋势及使用原则： 趋势：离子强弱、离子亲和性、离子浓度 使用原则：强与弱,1)预处理: 清水浸泡 80%90%乙醇浸泡24小时 4050热水浸泡2小时、洗涤数次 4倍树脂量的2mol/L盐酸浸泡2小时，水洗直中性 4倍树脂量的2mol/L氢氧化钠浸泡2小时，水
7、洗直中性，抽干备用， 转变为所需类型。,（3）离子交换的操作,2）再生、转型 强酸、强碱树脂可用酸、碱、氯化钠等再生、转型。 弱酸、弱碱树脂只能用酸或碱处理。 树脂“毒化”后可用4050强酸、强碱浸泡处理。,3）保存阴凉处。短期可存放于1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液中。长期存放可加入适量防腐剂封存。树脂长霉可用1%甲醛浸泡1小时后进行再生处理。 4）装柱 粗细分布均匀、无气泡、无断层。 5）上样 初分离可达到饱和状态，细分离上样量为树脂总吸附量的1%-5% 6）清洗除杂 7）洗脱 增加洗脱液的离子强度或改变pH值。 阶段洗脱法，梯度洗脱法。,（4）工艺参数 树脂的选择 上样液的pH值、流速 洗
8、脱液的种类、pH值、流速、量,（5）离子交换吸附的特点 料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离过程具有浓缩作用； 应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短，并可在较高流速下操作； 吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高 离子交换剂种类多，选择余地大，价格较低。 处理物必须带电荷,9、利用大孔吸附树脂树脂对水提取物进行粗分（可不经过浓缩）,大孔吸附树脂是六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴，且孔径较大，在1001000nm
9、之间，故称为大孔吸附树脂。大孔树脂的表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用。已广泛应用于废水处理、医药工业、临床鉴定和食品等领域，在我国，采用大孔吸附树脂分离纯化中药提取液已越来越受到人们的重视。,（1）吸附的产生表面,（2）大孔吸附树脂的分类及使用范围 非极性大孔吸附树脂：不带任何功能基，疏水性较强，适合于从极性溶剂中吸附非极性物质 中等极性大孔吸附树脂：含酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分。既可由极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶剂中吸附极性物质。 极性大孔吸附树脂：含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂，
10、他们通过静电相互作用吸附极性物质。适宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质,（4）吸附树脂的筛选: 吸附量的测定、解析率的测定,（5）树脂吸附法的特点 直接从水中吸附物质，减少了蒸发浓缩的能耗 吸附容量大 可反复使用 基本用于苷类、生物碱、黄酮等中药有效成分的初步纯化,（3）操作步骤 （1）树脂的预处理 （2）装柱 （3）上样（吸附液的浓度、pH值、温度、上样吸附的速度） （4）洗脱（洗脱剂、pH值、解吸速度、解吸温度） （5）再生（95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性，再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性）,（6）中药复方采用大孔树脂吸附工艺的特点： （1）可提高中药制剂中有效成分的
11、相对含量：仅从固形物收率一项看，水煮法收率一般为原生药量的30左右，水提醇沉法收率一般为原生药量的15左右，而用大孔树脂技术仅为原生药的 25左右。可以克服传统中成药“粗、大、黑”的缺点。同时可节约成品的包装成本。 （2）产品不吸潮：水煎液中大量的糖类、无机盐、粘液质等强吸潮性成分，因不被大孔树脂吸附而除去，所以在作固体制剂时吸潮性小，易于操作和保存。 （3）缩短生产周期：免去静置沉淀、浓缩等耗时多的工序，节约生产成本。,（4）去除重金属污染，提高成品的国际竞争力。,10、聚酰胺吸附色谱法（可不经过浓缩） 聚酰胺化学性质：高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂，对碱较
12、稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶浓盐酸、冰醋酸及甲酸。 吸附原理：,影响吸附力的因素： 形成氢键数目：形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强,溶剂洗脱能力顺序： 水甲醇丙酮氢氧化钠溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,芳香化程度：分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱,成键位置：,与鞣质吸附不可逆,二 、精细分离方法,1、葡聚糖凝胶层析法 1）葡聚糖凝胶的分类 葡聚糖凝胶（Sephadex-G)：水中使用，分离多糖、蛋白质等物质 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20)：水溶液或非极性溶液中使用，可分离多糖、蛋白质等物质（水溶液中）或生物碱、黄酮等极性小的物质（非极性溶液中
13、）。在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。在pH2以下或强氧化剂中不稳定,2）、 Sephadex LH-20 的原理 Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。,3）、 Sephadex LH-20 洗脱溶剂。 Sephadex LH-20 洗
14、脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。正相系统以氯仿甲醇最为常见，先用50氯仿甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100甲醇冲柱。,4）、 Sephadex LH-20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 样品极性大，采用反相溶剂洗脱（甲醇水），样品用最少体积的甲醇水溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤！要是把Sephadex LH-20 堵了，就得将Sephadex LH-20 的柱头部分弃去）。如果样品极性小，则选用正相溶剂洗脱（氯仿甲醇），样品用最少体积的氯仿甲醇溶解，过滤后，湿法上样。,5）、 Sephadex
15、 LH-20的操作步骤,(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性大的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。,(2) 饱和层析剂：用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，防止气泡留在其中。约2-3小时后打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂。,(3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，离心或经过0.45um的膜过滤。,(4) 湿法上柱：样品体积应该占柱总体积的1-2%，,(5) 洗脱：控制流速，一般流速为5-30cm/h ，可参考厂家的一些参数;必要时更改极性（一般一种洗脱液就可以将样品洗脱完毕）。,（6
16、）再生：凝胶再生通常是用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗,6）、分离的技巧,（1） 流速不可太快，切切不可性急。 （2）柱子尽可能长， Sephadex LH-20 柱长的增加将极大地改善分离。（3） 馏分一定要接的细，可110，或120 个保留体积接成一馏分。 （4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，不可用Sephadex LH-20 分鞣质或原料中不能有 鞣质 （6）Sephadex LH-20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。 （7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离
17、的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。,7）、其它事项： 操作温度 4到40 保存条件： 新填料 4-25（干燥）；使用后填料 4-8，pH6-8，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20%乙醇，0.04%叠氮钠）,2、活性炭吸附法 1）概述：活性炭是一种用途极广的工业吸附剂，它是利用木炭、各种果壳和优质煤等作为原料，通过物理和化学方法对原料进行破碎、过筛、催化剂活化、漂洗、烘干和筛选等一系列工序加工制造而成。活性炭自1900年问世以来，其应用历程当中经历了两件大事，一是在20世纪20年代第一次世界大战中被用于制造防毒面具；二是在20世纪40年代数以百计的自来水厂用活性炭脱臭。活性炭的吸附性源于其独特的分子构造
18、，活性炭的内部有很多孔隙，每克活性炭的内部孔隙如果铺展开来可达到5001700平方米，正是这种独特的内部构造，使得活性炭具有优异的吸附能力，活性炭的应用非常广泛，比如：糖的脱色，军用防毒面具，香烟过滤嘴，空气净化器，自来水厂水处理，饮用水净化，解毒，醒酒，治理放射元素污染，降低土壤中残留农药，调理土壤性能，治理室内甲醛，蔬菜保鲜等等,2）活性炭的预处理（活化） ，120 加热4-5h，或先用稀酸、稀碱处理，水洗至中性再加热 3）层析用活性炭分类 、粉末状活性炭：颗粒很细，比表面积大，吸附力和吸附量大，柱色谱流速极慢，通常采用加压或减压操作，并加入硅藻土作为助虑剂。 、颗粒状活性炭：颗粒较粉末状
19、大，比表面积、吸附力和吸附量比其小，柱色谱流速易控制，可常压操作，为常用的活性炭 、锦纶活性炭：以锦纶为黏合剂，将粉末状活性炭制成颗粒状活性炭，比表面积介于两者之间，吸附力比两者弱，可用于分离前两种活性炭吸附力太强而不宜洗脱的化合物，用于分离酸性和碱性氨基酸效果好。,4）活性炭的在天然产物分离中的应用 非极性吸附剂，用于从水中吸附极性较弱物质及分离水溶性物质，如氨基酸、糖类及某些苷类，在有机溶剂中吸附力弱。 活性炭的吸引力：芳香族化合物对脂肪族化合物，大分子小分子，极性基团多极性基团少，,5）活性炭的使用方式 柱层析吸附，静态吸附,3、 硅胶吸附层析法（小规模、一次性材料）,（1）极性吸附剂，
20、溶质极性越强则吸附力越大，溶剂极性越大则对溶质的吸附力越小。 （2）活化吸附色谱；去活化分配色谱 （3）硅胶的分类 薄层层析用硅胶（颗粒小，一般小于250目） 硅胶H（不含黏合剂） 硅胶G（含煅石膏作为黏合剂） 硅胶HF254（含荧光物质，可在254纳米下产生荧光） 硅胶GF254（含煅石膏又含荧光剂） 柱层析用硅胶（颗粒粗） 硅胶H,（4）薄层层析（TLC） 、薄层板制备：配液、铺板、风干、活化（110-120加热半小时） 、点样：离薄层板一端约1.5处，点集中，量适度 、展开：上行法，最好先使层析缸中蒸汽达到饱和 、显色：通用显色剂：碘 、 Rf值测定：斑点移动距离与溶剂到原点距离之比 、
21、薄层扫描 ：含量测定 、斑点回收：标记、刮、洗脱,分析型或制备型,（5）柱层析： a. 装柱（干法，湿法） b. 上样（干法，湿法） c. 洗脱（洗脱剂极性从小到大） d. 收集与检测 注意事项： （1）尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，或用极性稍大的溶剂溶解样品后，以少量吸附剂拌匀挥干，上柱。 （2）一般以TLC展开时使组分Rf值达到0.20.3的溶剂系统作为最佳溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。 （3）为避免化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行分离。 （4）通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中常加入适量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾
22、、使斑点集中,少量极性大的溶剂可改善分离效果 （5）一般用来分离极性小的物质，极性大的物质吸附力太大，难以分离,4、 氧化铝吸附层析法（小规模、一次性材料）,氧化铝分中性、碱性、酸性三种 中性氧化铝（pH值7.5），用途最广，适用于分离生物碱、萜类、甾体、挥发油及在酸和碱性条件下不稳定的苷类、内酯等化合物 酸性氧化铝（pH值4-5）适用于分离酸性物质 碱性氧化铝（pH值9-10）适用于分离碱性和中性物质,操作事项参照硅胶层析法,支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等正相分配色谱： 固定相：水、缓冲溶液（极性） 流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂 洗脱顺序：化合物极性越小，越先出
23、柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分。,液-液分配柱色谱的最佳分离条件可以根据相应的薄层色谱结果（正相柱用正相薄层色谱，反相柱用反相薄层色谱）进行选定。,5、液-液分配色谱：,反相分配色谱： 固定相：石蜡油、化学键合固定相（非极性、弱极性） 流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂 洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。 反相硅胶：RP-2、RP-8、RP-18。三者亲脂性强弱顺序：RP-18 RP-8 RP-2。,6、高效液相色谱分离 HPLC,（1）高效液
24、相色谱法的特点,流动相:液体，一般为甲醇溶液，乙氰溶液 固定相：采用非极性的疏水键合相如十八烷基键合相（ODS）等 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 分离范围：可溶于水及有机溶液的物质,洗脱 等度洗脱 梯度洗脱：适于分析极性差别大的复杂组分 收集,（2）高效液相色谱法的分离过程 上样：,液相色谱,色谱柱：直径46mm,柱长1030cm,溶剂选择的一般原则： 资料，相似相溶，不反应；溶解度（冷-较小，热-较大）；对杂质溶解度很大或很小；沸点较低，易挥发；无毒或毒性小。单一溶剂或混合溶剂。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。 混合溶剂选用原则：易挥发溶剂溶解度应大,7、结晶及重结晶法,结晶操作： 配制过饱和溶液，趁热过滤去除杂，放置冷处；制成衍生物或盐,结晶纯度的判定： 形状均一、色泽均匀。 具有一定的熔点，熔距窄，在12的范围内。但要注意双熔点化合物。 色谱法：单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不同的溶剂系统展开，均为一个斑点者。,
