1、第三章 酶的分离纯化第三章 酶的分离纯化第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤 第二节 细胞破碎 第三节 酶的抽提 第四节 酶的纯化 第五节 酶的纯度与产量第六节 酶的剂型与保存第一节 酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926 年 Summer 制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。一、基本原则 二、 酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后
2、期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有：（1）低温 ：除少数例外，所有操作应在低温下进行， 有有机溶剂存在时，更应注意。二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。2. 抽提 3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节 细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。一、机械破碎法 二、物理破碎法三、化学破碎法 四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的
3、有如下几种。1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达 10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。 温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度
4、、溶液粘度，pH 值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。一般操作条件为：音频 10kHz 或 20kHz；功率 100、150W；温度 010；pH4-7；处理时间 3 10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。化学破碎法中，常用的化学试剂有： 有机溶剂和表面活性剂。在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞
5、破碎的方法称为酶学破碎法。第三节 酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。一、酶抽提的主要方法二、酶提取过程中应注意事项 根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。1盐溶液提取：大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.020.5mol/L。例如：用固体发酵生产的麸曲中的 -淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15molL 的氯化钠溶液或 0.020.05mol L
6、的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.50.6molL 的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：1温度：通常抽提温度应控制在 0-10oC（0-4 oC） 。对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在 37 oC 下保温抽提，效果较好。因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。第四节 酶的纯化一、酶纯化的一般原则 二、酶纯化中常用方法概述三、沉淀分离法 四、离心分离法五、过滤与膜分离 六、层析分离七、电泳分离 八、酶的结晶九、浓缩与干燥 十、酶纯化实例
7、三、沉淀分离法 沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离。在酶的分离纯化中，经常采用此法。沉淀分离的方法有很多，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等。1 盐析沉淀法 2 等电点沉淀法3有机溶剂沉淀法 4复合沉淀法（选择性沉淀法）四、离心分离法离心是借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，是酶的纯化过程中最为常用的一种方法。 进行离心分离时，应根据欲分离物质的大小，密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。1离心机种类及用途 2离心方法选择 3. 离心条件的确定五、过滤与膜分离1. 概述 2. 粗滤 3
8、膜分离技术六、层析分离1概述 2. 吸附层析 3离子交换层析 4分子筛凝胶层析 5 亲和层析七、电泳分离1、电泳基本原理 2、影响电泳因素 3、主要电泳技术八、酶的结晶结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，它是酶和蛋白质等生物大分子分离，纯化方法之一。同时，结晶化合物也是生物大分子结构分析研究的材料。1、蛋白质和酶结晶条件 2、结晶方法九、浓缩与干燥浓缩与干燥都是使酶与溶剂（通常是水）分离的过程，是酶分离纯化过程中不可缺少的环节之一。1. 浓缩 2.干燥一、 酶纯化的一般原则在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去；而大分子杂质包
9、括有：核酸、粘多糖、其它蛋白质。其中核酸和粘多糖易干扰后面的纯化、故最好预先除去。核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或 MnCl2 等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。余下就剩杂蛋白，而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来。在进行酶与杂蛋白分离工作时，为获得较好的分离效果，应注意以下基本原则：二、 酶纯化工作中常用方法概述现有的纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立的，主要有如下几类：1根据溶解度建立的方法：盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法及选择性沉淀法，等电点沉
10、淀法等。2根据分子颗粒大小、重量差别建立的方法：离心法、凝胶过滤法、超过滤法。1. 盐析沉淀法 （1）盐析法的原理：根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增加，表现为“盐溶”，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为“盐析”的这一特性，由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。在盐析条件下，蛋白溶解度与溶液离子强度间有如下关系：b. 加固体（NH4） 2SO4：当蛋白溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时，以加固体（NH4） 2SO4 为宜，加入量可查表，也可以下式计算：W = （g）式中： W：1 升 S
11、1 饱和度溶液提高到 S2 饱和度时，需加固体（NH4） 2SO4 的量（g）S2、S 1：分别为需达到的和原来溶液的（NH4） 2SO4 饱和度，A、B：常数，与温度有关，0 oC 时，A=0.27、B=70720oC 时, A=0.29、B=756（3）盐析时的 pH 控制：控制盐析 pH 可以提高纯化效果，一般盐析 pH 宜接近待纯化酶的等电点。因为等电点时，蛋白质或酶的溶解度最低，有利于盐析。另外，有些酶易与杂蛋白形成某种结合，从而干扰盐析，可控制 pH9，使它们带相同电荷，以减少络合物形成，改善盐析效果。（4）盐析时温度控制：盐析温度以 4oC 为宜。此条件下酶溶解度低而稳定性强（5
12、）盐析时的蛋白质浓度控制：蛋白质浓度是盐析时一个十分重要但又易被忽视的因素。一般蛋白浓度100ug/ml，盐析沉淀很难形成，而当 200ug/ml蛋白浓度 1mg/ml，沉淀虽能形成，但耗时，且回收率不高。因此为获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在 1mg/ml 以上。b. 分级沉淀：由于各种酶及某蛋白在不同浓度的盐溶液中，溶解度不同，故可采用分级沉淀法将其逐渐剥离。例如：兔肝 SOD 分离时，采用如下分的沉淀步骤：反抽提法为：先加（NH4） 2SO4 至 50%饱和度，得沉淀，再将沉淀悬浮于 42%饱和度（NH4）2SO4 液中，溶解杂蛋白，而沉淀物即为 RNA 聚合酶。反抽提法较一般分级沉淀法
13、，具有一定的优越性： 许多蛋白质从溶液中析出较为容易，是非特异性的，而要溶解却有相当高的特异性，故反抽提法可以比较细致地除去杂蛋白。 反抽提法提取，酶不易失活，可能是因为酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故。2. 等电点沉淀法（1）等电点沉淀法原理：两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质是不同等电点，由此可将酶纯化。3. 有机溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀法原理：利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法为有机溶剂沉淀法。沉淀原理如下：a.有机溶剂降低溶液的介电常数由于分子间的引力是与溶剂的介电常数成反比，而有机溶剂能降低溶液的介电常数，加入有机溶剂，蛋白质分子间引
14、力增加，溶解度降低。（3）温度控制：大多数蛋白质遇有机溶剂很不稳定，特别是在温度较高（室温）时，极易变性失效，故操作应在 0oC 以下进行。有机溶剂必须先冷到 -20oC-15oC，并在搅拌下缓慢加入，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离。（4）pH 控制：pH 以接近目的酶的等电点为宜。（6）有机溶剂沉淀法的优缺点a. 优点：沉淀易于分离，过滤，分辨率高，且有机溶剂易除去或回收，适用于食品工业用酶制剂的制备。b. 缺点：易引起酶变性失活，故必须在低温下操作且析出沉淀要尽快分离，分离出的沉淀物应立即用水或缓冲液溶解，以尽量减少沉淀中有机溶剂的含量。4复合沉淀法（选择性沉淀法）（1）复合沉淀法原理：
15、在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法将酶从复合物中重新析出，此即为复合物沉淀法。（2）酶沉淀剂：能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶（蛋白质）沉淀剂，常用的有单宁、聚丙烯酸等高分子聚合物。聚丙烯酸（Polyalrylic acid，PAA）PAA+酶PAA- 酶PAA-酶 +Ca2+PAA-Ca2+酶PAA- Ca2+SO42-CaSO4+PAA（可循环使用） 1离心机种类及用途（1）常速离心机：转速 8000r/min，用于细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒的分离。 （2）高速离心机：转速 1000025000r/min，用于各种沉淀物、细胞碎片及较大细胞器的分
16、离。（3）超速离心机：转速 2500080000r/min，有制备用、分析用、制备分析两用 3 种类型。用于生物大分子、细胞器、病毒等的分离纯化以及纯度检测、沉降系数 和分子量的测定等。 2离心方法选择: 主要有差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心。（1）差速离心 ：a. 含义：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。（3）等密度梯度离心a. 含义：当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置(等密度点)，形成区带。这种方法称为等密度梯
17、度离心。或称为平衡等密度离心。3. 离心条件的确定离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法，离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间。此外还要注意离心介质溶液的pH 值和温度等条件。 (2) 离心时间离心时间依据离心方法的不同而有所差别。差速离心时间：是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。等密梯度离心时间：是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。密度梯度离心时间：是指形成界限分明的区带的时间。对于密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验后确定。 （4）差速离心分离实例：差速离心分离细胞内组分1. 概述（1）过滤
18、含义：借助于过滤介质将不同大小，不同形状的物质分离的技术。（2）过滤介质有：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷及各种高分子膜。其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤称为膜分离技术包括微滤、超滤，反渗透等。2. 粗滤（1）粗滤含义：借助过滤介质截留悬浮液中直径大于 2m 的大颗粒，而使固液分离的技术称为粗滤。（2）粗滤常用介质：滤纸、滤布、玻璃纤维、陶瓷滤板等。（3）粗滤种类：常压过滤、加压过滤、减压过滤。b. 加压过滤：加压过滤以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。在生产中常用的各种压滤机属于此类。为了加快过滤速度和提高分离效果，可采用添加助滤剂，降低悬浮液粘度和适当提高温度等措施。加压过滤设备比较简单；过滤
19、速度较快，过滤效果较好，在生产中广泛使用。3膜分离技术：（1）膜分离技术的含义：借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。（2）膜分离技术常用的薄膜：膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜，有时也可用动物膜和羊皮纸等。b. 电场膜分离：电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正，负极，在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。电渗析和离子交换电渗析即属于此类。用途： 透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化
20、，从中除去小分子物质，也可用于溶液的脱盐等。透析设备简单，操作简便。但透析时间长；若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止；透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较低。1概述（1）层析法基本原理：2. 吸附层析（1）吸附层析含义：3离子交换层析：（1）离子交换层析的含义：一般规律是：h. 交换剂选择，应考虑交换容量，交换容量包括两个方面：总交换容量：每克干离子子交换剂上带有的总交换基数。实效交换容量：特定实验条件下，实际可用于交换的交换基数，它与介质的 PH、离子强度、温度等有关，也因目的酶分子大小而显著不同。一般情况，离子交换纤维素的容量小于凝胶，而对于离子交换凝胶，分子量为10,0
21、00100,000 的选择 SephadexA-50 或 C-50，分子量大于 400,000 的，选择 SephadexA-25或 C-25，或 Sepharose。b. 上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均匀地分布于交换剂的全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和为止。c. 洗脱和收集：上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附的物质洗出。然后用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力从小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到分离的目的。注意：酶液中除了欲得到的某种酶以外
22、，还含有各种杂质。酶和杂质与离子交换剂的亲和力不同，采用适当的洗脱液洗脱，可使酶与杂质分离。d. 离子交换剂再生：洗脱收集完毕后，为使离子交换剂再次使用，需要经过再生处理。含杂质较少时，再生只要用酸，碱或盐进行转型即可。但在离子交换剂含杂质较多的情况下，再生时要先经过酸、碱浸泡清洗，用水洗至中性，然后再转型，以备再次上柱进行交换。如此循环往复，离子交换剂可反复使用一段较长的时间。如离子交换柱要较长时间停用，可在再生后，加入适当的防腐剂以防止微生物生长。阳离子交换树脂常用 0.02的叠氮钠作为防腐剂。而阴离子交换树脂常用的防腐剂是 10ppm的苯乙酸汞等。 4分子筛凝胶层析（1）凝胶层析基本原理
23、：是以各种多孔凝胶为固定相利用溶液中酶与其它杂质分子大小不同而进行的分离技术。示意图如下：为定量衡量各组分流出顺序，常采用分配系数 Kd 来量度。式中：Ve洗脱体积，表示某一组分物质从加进层析柱到流出液中该组 分出现高峰时，所需的洗脱液的体积（ml） 。V0外体积，即为层析柱内凝胶一颗粒间空隙的体积（ ml）Vi内体积，即为层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml ）当某组分 Kd=1 时，即 Ve=Vi+Vo即：洗脱体积=外体积+内体积，说明该组分可自由扩散，进出全部凝胶微孔，最后洗脱出来。而其它组分 Kd 应介于 0-1 之间，Kd 小的先洗脱，Kd 大的后洗脱出来。Ve、Vo、Vi 与
24、凝胶种类、凝胶型号、凝胶处理方法，装柱量以及装柱质量等因素有关，在装好凝胶柱后，可通过实验测得 Vo，Vi，及某些已知组分的 Ve，从而计算 Kd。（2）凝胶层析法常用凝胶：主要有葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶a. 葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶是以葡聚糖(葡萄糖通过 -1,6 糖苷键结合而成的线性高分子 )为单体，以 1,2环氧氯丙烷为交联剂，聚合而成的具多孔网状结构的高分子化合物。商品名为Sephadex。其网孔的大小可通过调节交联剂和葡聚糖的比例来控制，交联度越大，网孔越小，交联度越小，网孔越大。其结构如下图：b. 琼脂及琼脂糖凝胶：琼脂：琼脂是一种天然的多糖混合物。将琼脂加一定量的水，
25、加热溶解后冷却凝固成凝胶。琼脂凝胶有较大的孔隙，能分离的物质分子量范围较大。但其强度较差，而且含有大量负电荷，用于凝胶层析时，会影响物质的分离效果。琼脂糖凝胶：琼脂中带负电荷的组分为琼脂胶(agaropectin) ，含有磺酸基和羧基，通过精制，可将琼脂胶除去，而得到不带负电荷的琼脂糖(agarose)。琼脂糖是由 D半乳糖和3, 6脱水 L半乳糖相间结合而成的多糖。琼脂糖可制成各种型号的琼脂糖凝胶。其商品名也有多种。如瑞典的 Sepharose(见下表) ，美国的 Bio-gel A，丹麦的 Gelarose 等。琼脂糖凝胶的特点：多孔，液体流动性好，取代基团多，对物质的吸附性弱，分离范围较
26、大，适用于蛋白质、酶、多糖等多种物质的分离。但其稳定性较差，温度超过 40会熔化，使用时 pH 范围在4 9 之间。 改善琼脂糖的稳定性：采用双环氧丙烷等双环氧化合物将其交联，制成交联琼脂糖凝胶。交联琼脂糖凝胶的结构坚实，保持了原有的多孔性和流动性等优点，适用的 pH 范围扩宽到 312，并可在 120以下加热灭菌，使之能更广泛应用。特点：聚丙烯酰胺凝胶的化学稳定性好，强度高，通过改变单体和交联剂浓度可使聚合成的凝胶孔径改变。但在浓酸或浓碱的作用下，酰胺键会水解而生成羧基，使凝胶带上电荷，成为离子交换基团，而影响凝胶层析效果。故，聚丙烯酰胺凝胶适宜在 pH2 11 的范围内使用。商品聚丙烯酰胺
27、凝胶有多种型号。（3）凝胶层析操作过程：a. 装柱：选择好凝胶的种类和型号后，首先将一定量的干燥凝胶粒悬浮于 510 倍体积的溶液(与洗脱液相同)中充分溶涨，然后减压排气，装进层析柱。装柱时应注意凝胶分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。柱装好后，不管使用与否，都应有液体(与洗脱液相同)浸过凝胶表面，以免混入空气。（4）凝胶层析法的应用：a. 作为分析工具，对混合物各组分进行鉴别。b. 作为脱盐工具。c. 高分子溶液浓缩，利用干胶的吸收性。d. 除热原。e. 测高分子物质分子量。f. 用于酶等物质的分离及纯化。5 亲和层析（1）亲和层析的基本原理：亲和层析是利用生物分子之间所具的专一而又可逆的亲和力
28、，使生物分子分离纯化的技术。酶与底物（包括辅助因子） 、底物类似物或其竞争性抑制剂之间都具有较高的生物亲和力，能专一而可逆地形成酶配基络合物。因此，当将这类配基偶联固定于载体作为固定相时，含有待纯化酶的溶液流经该固定相，该酶就能迅速而有选择性地与相应配基结合，而其它杂质流出固定相，从而达到纯化该酶的目的。（2）亲和层析的载体：a对载体要求：结构疏松，可使待纯化分子自由地与配基接触；必须具有大量可以和配基进行偶联反应的基团；最好是惰性的不和杂蛋白分子产生非专一吸附；能耐受偶联、吸附、洗脱各过程中 PH、离子强度、温度变化，以及变性剂等的反复处理。b. 常用载体：琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺
29、凝胶，纤维素等，其中以琼脂糖凝胶最理想，用的最多的琼脂糖 4B。a. 载体活化：偶联之前先须活化，一般葡聚糖和琼脂糖的糖羟基可用溴化氰活化，形成十分活泼的亚氨基碳酸盐衍生物。经活化后，如果配基的偶联基团是伯胺基或芳香胺基，则可直接与之偶联但如此联结的亲和剂，配基与载体距离太近，而酶活性部位常又在酶分子内部，难以与之结合，故通常在配基偶联前还需加一段短臂。b. 加臂： 在亲和层析剂的加臂中，应注意： 臂的长度必须适中，太短效果不大，太长则可能导致非专一吸附。 臂应有可以和载体及配基进行共价偶联的功能基团；不带电荷，但亲水，能经受化学处理。亲和层析剂中常用臂有三类： 碳氢链：如 ,二胺化合物,氨基
30、羧酸； 聚氨基酸：如聚DL丙氨酸，聚DL赖氨酸等。 某些天然蛋白质，如白蛋白等。其中第类最为常用。(5) 亲和层析的一般过程：亲和层析的操作过程主要包括：特定亲和层析剂的制备、预处理平衡、装柱、加样吸附、洗涤洗脱 、以及脱盐再生。a. 特定亲和层析剂的制备：采用琼脂糖凝胶为母体，选用适宜的配基制成亲和层析剂。例如：以细菌细胞壁的水解产物为配基，偶联于琼脂糖凝胶上，用于溶菌酶的分离纯化；用环状糊精作为配基，以环氧化物活化的琼脂糖凝胶为母体制成亲和层析剂，用于分离纯化 a淀粉酶等。 c. 洗涤：主要是除去非专一吸附的杂质，通常可用平衡缓冲液或其它缓冲液淋洗。d. 洗脱：是层析过程中非常关键一步，常
31、用洗脱方式有：非专一性洗脱： 包括改变温度洗脱、改变 PH 洗脱、 改变离子强度洗脱、改变溶剂系统洗脱、加促溶剂洗脱和电泳解吸。专一性洗脱： 包括半抗原竞争性洗脱、抑制剂竞争洗脱和底物类似物竞争洗脱。其他洗脱方式：包括变性、断裂和降解洗脱。通过改变温度进行的洗脱：这是由于溶质从液相吸附到惰性固相载体是一个放热过程，因此，升高温度能使吸附平衡移向解吸方向。而且，吸附过程愈是放热大，随着温度升高愈易被洗脱。亲和吸附服从这一规律，当被吸附的分子有不同的吸附热时，通过改变温度就可将它们分别洗脱下来。这种洗脱方法的优点是洗脱液中不需要加入盐类等外来因素。例如：吸附于 AMPSepharose 的激酶和脱
32、氢酶类，这种洗脱方式特别有用，通过线性温度梯度洗脱就能达到好的分离。 通过加促溶剂进行洗脱：当亲和力很大，如，k d10-6 molL 时，加促溶剂洗脱可达到较好的效果。如：加螯合剂可解吸由多价阳离子通过静电键而形成吸附；加入与水相混溶的溶剂，如乙二醇、二甲亚砜、二甲乙亚胺等可解吸由范德瓦尔力和疏水键建立的专一性吸附。由于促溶离子具有破坏水的结构并削弱疏水键的作用，因而也可直接用作解吸洗脱剂。促溶离子在免疫亲和层析中应用最多，它们的洗脱效果有如下规律： 专一性洗脱：主要用于“族”专一性吸附剂或者结合力较低(如 10-6 molLk d10-4 molL)的情况。进行这种洗脱时，常采用半抗原、类
33、底物、抑制剂、辅助因子或其他与被吸附的成分有特殊亲和力的物质。它们或者能竞争性地和被吸附物质结合，或者能竞争性地和配基结合，从而将目的酶替换洗脱出来。例如：用 NADH 将激酶或脱氢酶从 5AMPSepharose4B 上洗脱下来。 洗脱方式：通过升高亲和洗脱剂浓度进行浓度梯度洗脱。用几种不同的解吸剂(包括亲和洗脱剂) 进行脉冲洗脱。 变性、断裂和降解洗脱变性洗脱：在常用的洗脱都不适用时，可以选择较激烈的变性手段进行洗脱。但是，这种洗脱也可能导致不可逆变性，而且即使是可逆变性，随时间延长也可能向不可逆转化，故在洗脱后应立即除去变性剂。例如：可以加脲、盐酸胍等，在低 pH 条件下使被吸附的酶构象
34、发生可逆改变而解吸下来。1、电泳基本原理带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳，不同物质，由于其带电性质及颗粒大小、形状不同，因而在一定的电场中，它们移动方向和移动速度也不同，故此可使它们分离。在电场中，颗粒移动速度以泳动度（或迁移率）表示，泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度，可用下式表示：2、影响电泳因素(1) 电场强度：电场强度指每 1cm 距离的电压降。电场强度越高，带电颗粒泳动速度越快。一般 E 为 2 10V/cm，V 为 100 500V，为常压电泳，电泳时间从几十分钟几十小时，常用分离大分子。E 为 20200V/cm，为高压电泳，电泳时间几分
35、钟几小时，多用于分离小分子物质。(2) 溶液 PH：PH 影响带电颗粒的解离，也即决定了颗粒所带净电荷的多少。对两性电解质，PH 偏离 PI 越远，带电荷越多、泳动速度越快，PH=PI ，其净电荷为零，不移动。(3) 离子强度：溶液离子强度越高、颗粒泳动速度越慢。一般离子强度为 0.020.2 较适宜。(4) 电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。电渗将改变颗粒在电场中的泳动速度。例如：在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负电荷，而使与纸相接触的水分子感应而带一些正电荷。水分子便向负极移动并带动溶液中的颗粒一起向负极移动。若颗粒本来向负极移动，则其表观泳动速度将比其本来的泳
36、动速度快；若颗粒原来向正极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的泳动速度；净电荷为零的颗粒也会随水向负极移动。3、主要电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）种类：按操作方式分为：垂直管形盘状电状、垂直板型电泳。按凝胶组成系统分为：连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓 度梯度凝胶电泳、SDS凝胶电泳等。a. 连续电泳：b. 不连续电泳：c. 浓度梯度凝胶电泳：d. SDS凝胶电泳：主要用于测蛋白质分子量。连续凝胶电泳：采用相同的凝胶，即采用相同浓度的单体和交联剂，用相同 pH 值和相同浓度的缓冲液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺(bis)
37、在催化剂的作用下聚合而成的。常用催化剂如下：不连续凝胶电泳：电泳凝胶由二层或三层不同孔径、不同 pH 的凝胶层组成。不连续凝胶电泳能使稀样品在电泳过程中浓缩成层后再进入分离胶分离，从而提高分辨能力。（见示意图）不连续凝胶电泳的凝胶层由上至下分别为：(1) 样品胶：是包含样品的大孔径凝胶，丙烯酰胺浓度为 2.5%，在 pH 6.76.8 的 Tris-HCl缓冲液中聚合而成。其目的是防止样品对流损失。有时可用 10甘油或 520蔗糖与样品液混和后加样，而取代样品胶。(2) 浓缩胶：用于使样品浓缩成层的大孔径凝胶。除了不含有样品以外，其浓度、pH 值和聚合方法均与样品胶相同。浓缩胶浓缩样品成层的原
38、理：(1) 由于在各层凝胶中均含有 TrisHCl，HCl 几乎全部解离为 C1-，C1 -在电场中泳动速度最快，称为快离子或先导离子；在电极缓冲液中含有甘氨酸，甘氨酸进入样品胶和浓缩胶后，由于浓缩胶层的 pH 为 6.76,8，甘氨酸只有 0.1 1.0解离成负离子，在电场中泳动速度很慢，称为慢离子或随后离子；而样品液中所含的酶、蛋白质等组分的泳动速度介乎快离子和慢离子之间。当电泳开始后，快离子速度最快，走在最前面，与其后面的酶或蛋白质之间形成一个离子浓度较低的低电导区，低电导产生较高的电位梯度，这种高电位梯度使落在后面的蛋白质或酶分子加速移动，逐渐赶上走在前头的蛋白质或酶分子，从而使样品在
39、快离子和慢离子之间被浓缩成薄薄的一层。 浓度梯度凝胶电泳：电泳使用的凝胶，其丙烯酰胺浓度由上至下形成由低到高的连续梯度。梯度凝胶内部孔径由上而下逐渐减小。电泳后不同分子量的颗粒停留在与其大小相对应的位置上，故此，浓度梯度凝胶电泳适宜用于测定球蛋白等分子的分子量。浓度梯度凝胶的配制：采用梯度混合器配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室，两室的液面保持同一水平。浓溶液和稀溶液中都按比例含有催化剂。但催化剂的量要控制好，以便有足够的时间制成梯度凝胶。启动梯度混合器后，流出的混合液经过导液管小心地引进玻璃管或玻璃板之间。在液面加一层蒸馏水，然后垂直放置，让其聚合成浓度梯度凝胶。梯度范围由样品中各组
40、分的分子量决定。SDS-凝胶电泳： 在聚丙烯酰胺凝胶制备时，加入 12 的十二烷基硫酸钠(SDS)，制成 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。SDS-凝胶电泳主要用于测定蛋白质的分子量。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率主要决定于其所带的电荷以及分子的大小和形状。但在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定量的 SDS 以后，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而与分子形状及其所带电荷无关。在一定的条件下，蛋白质分子量与其电泳迁移率的关系可用下式表示： （2）等电聚焦电泳a. 等电聚焦电泳原理：利用两性电解质载体（商品名为 Ampholine） ，在电场作用下，能形成一个由阳级到阴级连续增高的 PH
41、 梯度，当蛋白质，酶或多肽进入这个体系时，不同蛋白质即移动到与其等电点相当的 PH 位置，从而使不同等电点蛋白质得以分离。c. 载体两性电解质的必备条件： 在等电点状态下有足够的缓冲能力，以便控制好 pH 梯度。 在等电点状态下有足够的导电能力，以便使一定的电流通过。而且要求各个等电点不同的两性电解质有相同的导电系数，使整个体系中电导均匀，否则电导不均匀时，电位降有大有小，难于保持 pH 梯度的稳定性。d. 理想的载体两性电解质合成：用具有几个 PI 值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应。见下图e. 密度梯度等电聚焦：采用密度梯度溶液使 PH 梯度稳定
42、，以防止对流和避免已分离组分重新混和。密度梯度由重溶液和轻溶液在梯度混和器中，配制而成，常用密度梯度溶质是蔗糖、甘油，也可用乙二醇、甘露醇、右旋糖酐等。密度梯度溶液配制：重溶液（例如 50%的蔗糖溶液） ，一部分载体两性电解质和样品液置于梯度混和器的混和室，而轻溶液（如蒸馏水） ，部分载体两性电解质，和样品置于贮存室，启动搅拌器，打开阀门，流出液经导液管小心引入等电聚焦柱中，制成等电聚焦系统1、蛋白质和酶结晶条件(1) 纯度：蛋白质和酶在溶液中必须达到一定纯度，才能结晶。一般，纯度不应低于 50%，纯度越高，越易结晶。但已结晶的制品不表示达到绝对纯化，一般可进行多次重结晶，每次重结晶，纯度均有
43、提高，直到衡定为止。(2) 浓度：浓度越高，越有利于溶质中分子间的相互碰撞聚合，故越有利于结晶，但浓度过高，结晶杂质含量多，且晶形不好。故应控制适宜浓度。(3) PH：结晶液 PH 应选择在被结晶的蛋白质或酶的等电点附近。2、结晶方法：盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法，等电点结晶法。(1) 盐析结晶法：在适宜温度、PH 条件下，缓慢增加酶液中盐浓度，使酶的溶解度慢慢降低，进行酶结晶。(2) 有机溶剂结晶法：在适宜条件下，加入有机溶剂，令酶结晶析出。1、浓缩浓缩的含义：从低浓度酶液中除去部份水或其它溶剂而成为高浓度溶液的过程。(2) 浓缩方法：浓缩方法主要有蒸发法、冰冻法、吸收法、超滤
44、法等。c. 吸收法：是一种通过吸收剂直接吸收除去溶液中溶剂分子使溶液浓缩。吸收剂的要求：与浓缩液不起化学反应； 对生物大分子不起吸附作用；易与溶液分开；除去溶剂后能重复使用。实验室中常用吸收剂：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶。2、干燥干燥含义：将固体、半固体或浓缩液中的水分（或其它溶剂）除去一部份，以获得含水分较少的固体过程。(2) 干燥方法：a. 真空干燥：真空干燥是在可密闭的干燥器中进行。干燥器与真空装置相连。操作时，一边抽真空一边加热，使酶在较低的温度下蒸发干燥。汽化产生的水蒸汽在进入真空泵之前，通过冷凝装置凝结收集。d.气流干燥：气流干燥是在常压下利用热空气流直接与固体或半固体状态
45、的制品接触，使水分蒸发而得到干燥制品的过程。气流干燥设备简单，操作方便，但用于酶制品干燥时，酶活力损失较大。为了减少酶的变性失活，提高干燥质量，要控制好气流温度。温度不能太高，并要使气流的流通性保持良好，以便把蒸发的水汽及时带走，同时要经常翻动制品，使干燥均匀。实例从猪肉中纯化腺苷酸激酶。其催化反应为：纯化步骤：见下图第五节 酶的纯度与产量一、活力测定在酶的抽提和纯化过程中，为了知道选择方法和条件是否合适，每一步骤前后，都要进行酶活力测定，并作出总活力与比活力的比较（前已述）一般情况，比活力愈高，酶的纯度也愈好，但它不能说明实际纯净程度是多少三、纯度评价为获知新纯化的酶是否均一纯净，须进行纯度
46、鉴定，酶纯度鉴定的方法主要有以下几种。（见下表）第六节 酶的剂型与保存一、酶的剂型主要有以下四种1、液体酶制剂：包括稀酶液和浓缩酶液。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。该种剂型比较经济，但不稳定，而且成分复杂，只适用于某些工业部门如纺织工业等直接应用。二、酶的稳定性与保存1、影响酶稳定性因素温度：大多数酶可在低温（04）使用、处理和保存。也可在液 N2 或-80 中冻结保存。(2) pH 和缓冲液：大多数酶在各自特定 PH 范围内稳定。个别低分子量酶如溶菌酶、核糖核酸酶等在酸性 PH 条件下稳定。缓冲液的种类有时也会影响酶稳定性，如 Tris-HCI 缓冲液在 PH7.5 以下，抑制某些酶活性。2. 稳定酶的方法(1) 添加底物、竞争性抑制剂和辅酶。(2) 添加 SH-保护剂，如谷胱甘肽、巯基乙醇等。(3) 添加低分子无机离子，如 Ca2+能保护 a 一淀粉酶，Mn 2+能稳定溶菌酶等。(4) 制成固定化酶也是提高酶稳定性的好方法
