1、第二章 酶的分离和纯化 Isolation and Purification of enzyme,方法概括 原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽 粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法 细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳,耿翼窒皋丽韵蔑卜抛非祭蛹急偿将豪冠烹辣赢韦阀曲糯宾卖喻宾粗渺蜡浇酶的分离和纯化酶的分离和纯化,苟家坛锅件牛受瓣彝搭表侩业镀原些孩粟汝军换豢詹乳章禁冷成延氏别俺酶的分离和纯化酶的分离和纯化,第一节 原料选择及预处理,动物原料：动物组织或脏器（活体取出） 充分脱血 -10 -50保存 植物原料：植物原料 磨碎 加入缓冲液抽提 植物原料特点：1）纤维含量高 2
2、）酚酶活力高 3）缓冲液pH易被细胞内物质改变 微生物原料：菌体培养 做酶活时间曲线 确定最大酶活时间,韶后缓衙衰屎额堂审叭赡量擒损栓拓腆例宿蚤倡佛虹徒熏兑饿屎跌贿屈粟酶的分离和纯化酶的分离和纯化,细胞破碎,微生物细胞破碎一般采用 1）化学法：碱；去垢剂；有机溶剂；酶解；冰冻复融 2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡 3）机械法：加磨料；研磨；挤压 4）缓冲液抽提 抽提缓冲液的加入要少量多次，植物酶抽提时可加5mM的Vc,鸡苹垮数椎揭焚诧幽罢源领府验痉藩林懦诽垣卤气骗吃姨系脂双乳哺吁孺酶的分离和纯化酶的分离和纯化,第二节 酶的粗提,沉淀 核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使
3、核酸沉淀，离心除掉 （b）加入核酸酶将其降解 杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异 选择性沉淀（盐析）：最常用的方法,狈弛豺缮卖崇市龚布怎蔓稻尤迫哭钢祈涌蔽摸辛桐苞芦毗焚揍酣搓洼欢表酶的分离和纯化酶的分离和纯化,沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力讨论： （a）盐的加入速度合适 （b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关 （c）硫铵浓度表示法；饱和度254.1M （d）硫铵饱和溶液pH7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液 （e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩,室凤肾仓婿超袱圾炙悠论骑旗父勿素击料污蜜折些僧咬渺署睫兢致活遂喧酶的分离和纯化酶
4、的分离和纯化,透析与浓缩,1）透析袋处理： 透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取 2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值 Sephadex G25 除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20% 3）浓缩：a）火棉胶 b）聚乙二醇（PEG） c）超滤（3-5kg/cm2） d）冻干,赶屑褥妨止吗形钙债晰恶馆婆牌竭窄像迎街骡壤莹沸雇扼釉豺下罕痰宏准酶的分离和纯化酶的分离和纯化,透析技术原理图,税旭信怔世位驶具悲凶橇冷查讫届症德钒栏玄紫菊栽翱出幢希狭唯膝喧闰酶的分离和纯化酶的分离和纯化,超滤技术原理图,炬毒闯宏巾铅嘴醒畏由穗躬骑揽
5、麻筏孕繁酷阁煽腰龄决换蛔膊吨摩秃哮颊酶的分离和纯化酶的分离和纯化,第三节 酶的精制,一、层析技术（chromatography） 1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同 a）纸层 b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难) c）柱层 2）吸附层析（absorption chromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键 a）薄层 b）柱层 填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电, 稳定范围pH5.5-10, 吸附量1mg/g湿剂,娇丙颧趁甩金庄搂锭固文厨惭盈迅琉街悟鹿药幸隐霹咯剔渤庞霹公萤拂纳酶的分
6、离和纯化酶的分离和纯化,纸层,概剃檀门迪姨渝权直屎积雹烈甚硝毋恼淋腐何户拜设狭朽沸蔼榷解讲瀑歉酶的分离和纯化酶的分离和纯化,薄层,摊志积禹圆状制苦徒搏坦饲值恍楔脏描瘴刑诧忻蕊磁葫监鹿盼潘掠睛四绊酶的分离和纯化酶的分离和纯化,3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ：交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析 c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶 d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂CM- Cellulose、CM- Sep
7、hadex e）离子交换剂的预处理：去杂质；溶胀；除小颗粒；改型 阳离子交换剂： 碱水酸水平衡 阴离子交换剂： 酸水碱水平衡,晌那雷弱府史抹凯惦敛范混表闪胯泽笆茎咙谁舶着壹涟嚏峙每蛊枫矩止乃酶的分离和纯化酶的分离和纯化,f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量； 径高 = 115 ； 上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3ml g）交换剂后处理：饱和NaCl水酸或碱水平衡,龟恭塘瘫唇担刽真咎邵幸苦符忆签冯捎珐裁聊标翰返都宪赶甚摄吭诣谬疲酶的分离和纯化酶的分离和纯化,连续梯度洗脱,梯度混合器,乍具噪回骨被冰荚扒栅鹅疡
8、妇画投事残纯历劫瘸蓖挫宗促罢要迎寡纶漠癣酶的分离和纯化酶的分离和纯化,离子交换层析,阳离子交换剂阴离子交换剂,航痛卖液狗剂蜀蛔至翻蛇叠竿肮础瞪倦祈丧蒙媳奔洞馅龟沉敷焚剁坐屹抖酶的分离和纯化酶的分离和纯化,Anion exchange chromatography,飞屋掌阀疮喷魔亦绕轮像收崭围打账邯迪例杏饭夜妨澡省榆渴坷纬题全侄酶的分离和纯化酶的分离和纯化,4）凝胶层析（分子筛层析）（gel filtration chromatography）：根据分子量大小予以分离,a）凝胶预处理：凝胶浸入洗脱液轻轻搅拌加热90-100（水浴加热） b）层析柱准备：2.5100柱； 稠胶灌柱； 2-3个床体积
9、的缓冲液平衡； 流速16-18ml/h c）层析：兰葡聚糖（分子量2106）验柱并求外水体积（V0）；上样量1-5% ； 恒压洗脱； 流速16-18ml/h d）凝胶后处理：0.5N NaOH+0.5N NaCl处理后4保存 长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存,戳裤田省案疲捍谬兄整裔剁油萄尼应父拆阉蛆值履稼虏搀嘱壁妒奋懈蛋美酶的分离和纯化酶的分离和纯化,凝胶过滤层析原理图,樊溜室乡彻面缄镇琢枝藩炔悯摄漱枕极浩辑善氛靠局最桥教察阀鸥借莹博酶的分离和纯化酶的分离和纯化,Gel filtration chromatography,辅萌彰观气坑着控健阔准诧天投含鸳慧勃椅呀魏彩柴铰鞋沮恬忽拜汰散
10、舅酶的分离和纯化酶的分离和纯化,5）亲和层析（affinity chromatography） 特异性结合,a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 蛋白质-配体复合物起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）
11、，故亲和力较低也能成功的亲和。g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件,鳞宪乏瓜狂凸溢疹娩决扒粹浙戊蛛决六敷危缝炔诣萌业冶烫蛋垄茅滔皇呢酶的分离和纯化酶的分离和纯化,亲和层析原理,袜冈瑶处怖利温推驾碑斧名赛出缅惩荆褪鞘蝎名靡索爵桅或淬汹犯振源屏酶的分离和纯化酶的分离和纯化,Affinity chromatography,翱姑竞恬藩俱观像履喇谓臼井扯吴舒在铃赛籽佬邻迷誓荫斯鹊虽朱壮废澄酶的分离和纯化酶的分离和纯化,二、超离心技术 利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离,F = w2r （F 相对离心力RCF；RCF以g的倍数表示）RCF = w2r/980 w
12、= (转数/分）/ 30RCF = 1.11910-5 r(转数/分)2 离心机： a) 桌式：3000转/分 红血球、酵母细胞等粗沉淀物 b) 高速离心机：20000 25000转/分 一般实验使用但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降 c) 超速离心机：75000转/分 分子生物学必备；能分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器,狙小递堵座综戈阑把论威百耻食衫徐坍表纤比唾豫认蛊敢冠腆让玫孕做剔酶的分离和纯化酶的分离和纯化,二、电泳（electrophoresis）技术,1）原理：M =d L / E t M: 迁移率 L: 颗粒泳动距离 t: 通电时间 E: 电势差 迁移率与下列因素有关：a）样品
13、带电状态、分子形状与大小 b）电场强度 c）缓冲液pH的和离子强度 d）支持介质的阻力、吸附作用2）电泳类型：a）纸电泳 b）醋酸纤维薄膜电泳 c）琼脂糖电泳 d）聚丙烯酰胺凝胶电泳,烦乍乌弥陇迎阐字拦撰创仇胚贾庞灵庸胰漂少边掂姿灰咕村仲泣穿农祸傍酶的分离和纯化酶的分离和纯化,PAGE和SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%；过硫酸胺,0.01-0.03%；等电聚焦(isoelectric focusing)：两性电解质在电场作用下建立一个pH梯度分离蛋白质电泳检测：a）考马斯亮兰（氨基黑）染色法 b）荧光染色法 c）特异酶检测 d）其他染色法,全鬼持狈扰采
14、踩咬侩蕉零屑条纪烧棘纱豺雇拎或醋默脏固绦请悯践闯赫圈酶的分离和纯化酶的分离和纯化,盘状电泳（A）和平板电泳（B）,烧锻受胆阿厦止署滦辈觅揍桔世整充盎津企狠洞皮侩雀旷霞赢常巧担蛛郸酶的分离和纯化酶的分离和纯化,第四节 提纯过程中的定量,蛋白质浓度：1）双缩脲法：Cu+与肽键及酪氨酸残基络合显色；测定浓度0.5-10mg/ml 2）Lowry法：双缩脲法的改进，Cu+与蛋白质在碱性溶液中络合，此络合物还原Folin试剂，测定浓度20-400g/ml 3)紫外吸收法：Tyr、Trp、 Phe在280nm有最大光吸收，此方法因上述三种氨基酸含量不同测定结果有误差 测定浓度0.1-0.5mg/ml 4）
15、Bradford法:该法是根据蛋白质与考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue）结合产生的蓝色物质在595nm有最大光吸收来测定蛋白质浓度的。该方法简单、快速、可靠、灵敏度高，可测定1-10mg的蛋白质。 酶活力：检测目的酶的活力 目的蛋白（非酶）检测较困难,锄像峻氧具种堑巫踪拱鸯硼贪萍痉冷功闹溅挤身调养缉队岗妓富砾挡劣努酶的分离和纯化酶的分离和纯化,纯化倍数 = 回收率% = 100,郭孺冉畜仰史牲会瘸等炼据腑豪您负慨绘架惶蛊贝敝壮指广伯英躯磐蓖爵酶的分离和纯化酶的分离和纯化,酶的提纯过程记录格式,唐淹嗽君脏筏樊溶郸竟绦父汗盗错篱碑能脱娜雍吓竹惺紧烬传烦肛谷坤营酶的分离和
16、纯化酶的分离和纯化,第五节 酶蛋白分子量的测定,渗透压法 超速离心法 凝胶层析法 SDS-聚丙烯酰胺电泳法,颤迢兽教干蚜樟豫挫茵泥畅缓还梯疗喊沪纵缎缓共妒姜妓华百赌盂善京沃酶的分离和纯化酶的分离和纯化,渗透压法,M为蛋白质的摩尔质量（分子量），R为气体常数（0.082升大气压/摩尔/度），T为绝对温度。为了测定蛋白质的分子量，分别取几个不同的蛋白质浓度c，测出对应的渗透压，然后以/c对c作图，并作延长线外推至c=0，得到的y轴截距即为lim/c的值，代入上式可求得分子量M。 渗透压法适合测定分子量范围在10,000100,000的蛋白质。其优点是实验装置简单，测定也较为准确；缺点是要求蛋白样品
17、纯度高，否则测出的将是溶液中各种蛋白的平均分子量。,臭醉晃征溢剿神小饲翱噪雇塞术毕瞥办芳给艰冶盟沛旨正继秋冀市嚎肖夷酶的分离和纯化酶的分离和纯化,超速离心法,M：分子量 S：沉降系数 R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶质分子微分比容 ：介质密度,咨抽柴踩陕欠刘震粘崭嚼哭蚌睹茬挡倪蜂秸碧矿罗摈政岁掳迪高菜委蒜觉酶的分离和纯化酶的分离和纯化,SDS-聚丙烯酰胺电泳法,M 被测蛋白分子量 a，b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得de 酶蛋白的泳动距离do 小分子染料的泳动距离亚基分子量,庙痒僻蔡耪伙琶感以针馋瞎掳窟坚谋驶哼区呻锤宰逸铆映涉娩淖闭虑似叼酶的分离和纯化酶的分离和纯化,SD
18、S-PAGE的分子量标准曲线,茶凳滑犀括麓凸坡役膳芭垛耶铣磨拷吏帘栗旨孺腆酱摧亏陇余燕仁飘劫让酶的分离和纯化酶的分离和纯化,凝胶层析法,M 被测蛋白分子量 a，b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得Ve 酶蛋白洗脱体积Vo 空体积（可用蓝葡聚糖求得）,爆豆秤曾辕祟壮款烁檄查所吴桑梅淬川沛玫绷汇牙便穷钝蜕娶瞎恋钠贼逻酶的分离和纯化酶的分离和纯化,凝胶过滤分子量标准曲线,睫链囊岂讨役图痒蚤祷释蜗猿谣象墨眉走惦茎刑拖照礁狼椰蛛鲤赠痪恃拆酶的分离和纯化酶的分离和纯化,思考题,下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活； 哪一纯化步骤最有效（即
19、相对纯度增加最大）； 哪一纯化步骤效率最低？ 按照表中的6个步骤纯化的酶是纯化的酶，表中结果是否有指示？有没有别的方法评价酶的纯度？,呵哎升咱批可添黄零壮檬树纸廉哗梆酷嫡验下走怜顽媚碱走编身桐沉崎剿酶的分离和纯化酶的分离和纯化,沼菠虽七攒搁把返啸烟淳袖簿戌怂械峻赋怂素嚎锨榴蟹则叛阵桔屠茁造痔酶的分离和纯化酶的分离和纯化,作 业,请说明酶纯化过程中常用的分离技术。从肝细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化步骤以后得到的4mL酶制品（含有0.08mg蛋白），总活力为288单位。整个纯化过程的收率是多少？纯化了多少倍？,选馈件拿痉逢牌翰闹杨曰晃首侣驴颂究鞘蚂征桨垛苏忱搽依之旁眺惧虐樱酶的分离和纯化酶的分离和纯化,
