1、Western（试剂配制和操作步骤）试剂配制：（一）母液 （二）使用液 操作步骤：（一） 蛋白样品制备 （二） 蛋白含量的测定 （三）SDSPAGE 电泳 （四）转膜 （五）免疫反应 （六）化学发光，显影，定影 （七） 凝胶图象分析这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。耗材： 硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（2020cm），X-光片夹，X-光片，玻
2、棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/L TrisHClTris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调 pH 至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。PH HCl7.4 约 17ml7.5 约 16m7.6 约 15ml8.0 约 10ml10 SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml50 水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4 保存，保存时间为 1 周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）Tr
3、is (MW121.14) 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后用超纯水定容至 250ml，高温灭菌后室温下保存。20 Tween20Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml混匀后 4 保存。（二）使用液单去污剂裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100?g/ml PMSF）： 1mo
4、l/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸馏水至 50ml 混匀后， 4保存。使用时，加入 PMSF 至终浓度为100?g/ml（0.87ml 裂解液加入 1.74mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g (Na2HPO4 .H2O 1.56g Na2HPO4 .12H2O 3.58g)KH2PO4 0.2g蒸馏水至 1000mlG250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝 G250： 100mg95乙醇： 50ml磷酸：
5、100ml蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白标准曲线时，用 0.15 mol/LNaCl 进行 100 倍稀释成 1mg/ml，20保存。10分离胶和 5浓缩校10分离胶（两块胶，10ml） 5浓缩胶（两块胶，5ml）10%AP（过硫酸胺） TEMED 加 TEMED 后，立即混匀即可灌胶。
6、还原型 5XSDS 上样缓冲液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L 二硫叔糖醇， 10 SDS，0.5溴酚蓝，50甘油）0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8 ） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT ，MW154.5） 0.39gSDS 0.5g溴酚蓝 0.025甘油 2.5ml混匀后，分装于 1.5ml 离心管中，4 保存。电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L 甘氨酸，0.1 SDS）Tris（ MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35
7、 次。转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L 甘氨酸， 0.037 SDS，20 甲醇）半干转 1X 电转液：甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（ MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存，次溶液可重复使用 35 次。湿转 1X 电转液：甘氨酸（MW75.07） 11.25gTris（ MW121.14） 2.375g SDS 0.375g 甲醇 200ml蒸馏水至 1000ml溶解后 4 保存，次溶液可重复使用 35 次。TBS 缓冲液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/
8、L NaCl）1 mol/ LTrisHCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸馏水至 1000mlTBST 缓冲液（含 0.05Tween20 的 TBS 缓冲液） 20 Tween20 1.65mlTBS 700ml混匀后即可使用，最好现用现配。封闭液（含 5脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST 100ml溶解后 4 保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2 SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercapt
9、oethanol(-巯基乙醇) 700 l （通风厨里加）SDS 2g0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml超纯水至 100ml配制时，在通风厨内进行。 4保存。可重复使用 1 次。10X 丽春红染液丽春红 S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释 10 倍。显影液：H2O 365mlA 125mlB 5.1mlC 4.875ml4保存。定影液H2O 363.5mlA 125mlB 11.5.ml4保存。抗体 用 TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需 0.5ml化学发光试剂购自北京中山公司，为 Santa Cruz 产品，分 A 和
10、B 两种试剂。操作步骤SDS-PAGE转膜封闭一抗显色或化学发光显影二抗蛋白样品制备洗膜（一） 蛋白样品制备（1）贴壁细胞总蛋白的提取：（整个操作尽量在冰上进行）收集细胞，加裂解液 100ul 漩涡混匀，冰上裂解 30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。在 4下 12000rpm 离心5min，取上清分装于 0.5ml 离心管中并置于 20保存。（二） 蛋白含量的测定（1） 制作标准曲线1、 从20取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。2、 取适量的蛋白标准稀释至终浓度 0.5 mg/ml ；按照下表将 0.5mg/ml BSA 和稀释液 PBS 加到 96 孔板中，并取样
11、品2ul 加入 96 孔板中，加 PBS 至 20ul.（样品和标准品均设置复孔）3、 按 A:B=50:1 配制适量的 BCA 工作液，混匀，室温 24h 内稳定。各孔加入 200ulBCA 工作液 3730min测定 A562，求平均值，绘制标准曲线。（三） SDSPAGE 电泳电泳时间一般为 23h，电压为 80V 30min;120V 3h 较好，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围6% 50-150kD8% 30-90kD10% 20-80kD编号 1 2 3 4 5 6 7 80.5mg/ml BSA(ul)0 1 2 4 8 12 1
12、6 20PBS(ul) 20 19 18 16 12 8 4 0得到标准 BSA浓度(ugul)0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.512% 12-60kD15% 10-40kD配制10%的过硫酸铵配制12%分离胶（5ml)待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水聚合40分钟后，倒掉蒸馏水配制5%浓缩胶（2ml）灌浓缩胶插上梳子，聚合20分钟 注意：灌胶过程中避免产生气泡（四）转膜转膜详细操作过程：（1）转一张膜需准备 6 张 7.08.0cm 的滤纸和 1 张 7.38.6cm的 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。PV
13、DF 膜则在 M-OH 中浸泡 10min 以上后转入 TBS 液中平衡。将滤纸浸入 TBS 液中润湿。（2）在加有转膜液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。（3）将夹子打开使 黑 的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。 （一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。 ）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上） ，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很易裂） 。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻
14、刮去（浓缩胶影响操作） ，要避免把分离胶刮破。轻轻划开分离胶与玻板左右两边的接触面，不然取胶时容易弄破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡（膜盖下后不可再移动） 。在膜上盖 3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。注意膜在正极+侧，分离胶在负极-侧。标记正反面。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一
15、块冰来降温。湿转一般用 400mA 转移 1:30 h，根据分子量大小调整。（五）免疫反应（1）封闭：转完后将膜用去离子水或 TBST 从下向上浸湿后吸干，将膜在含 5%脱脂奶粉的 TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)的平皿中，室温下封闭 1h。（2）一 抗 孵 育 ：转移方法的选择：半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法； 适合
16、转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h将一抗用一抗稀释液或 TBST 稀释至适当浓度（在 15ml 离心管中） ；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育 1 2h 后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min 。( 本实验室用封膜机将膜蛋白密封)（3）二 抗 孵 育 ： 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育 12h
17、后，用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10min；再用 TBS 洗一次，10min ，进行化学发光反应。（六）化学发光，显影，定影（1）将 A 和 B 两种试剂在 EP 管中等体积混合；1min 后，将此混合液充分涂抹在膜蛋白面上；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。（2）在暗室中，将 1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm） ；打开 X-光片夹，把 X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上 X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，也可
18、选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开 X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为12min （20 25） ，温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为510min，以胶片透明为止 ；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。（七） 凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 高 背 景高背景高背景信号弱或者无信号信号弱或者无信号非特异
19、性条带非特异性条带信号下降太快信号下降太快信 号 弱 或 无 信 号原 因 解 决 办 法抗 原 量 不 足 增 加 上 样 量蛋 白 质 在 储存 过 程 中 降 解重 新 制 备 样 品转 膜 不 完 全 转 膜 后 确 定 转 膜 效 率 、 保 证 胶 与 膜充 分 结 合 、 保 证 电 极 正 确 装 配 、 控 制 转膜 温 度 （ 冰 袋 降 温 ） 、 优 化 转 膜 电 流 及时 间 。膜 的 错 误 选择选 择 合 适 膜 的 孔 径 ： 22kD 蛋 白选 用 0.45 m 孔 径22kD 蛋 白 选 用 0.22 m 孔 径抗 原 被 封 闭液 遮 蔽优 化 封 闭
20、液 、 缩 短 封 闭 时 间 、 减 小封 闭 液 中 蛋 白 浓 度 。抗 体 增 加 抗 体 浓 度 、 注 意 抗 体 储 存 条 件（ 避 免 反 复 冻 融 ） 。曝 光 时 间 过短延 长 曝 光 时 间底 物 延 长 底 物 孵 育 时 间非 特 异 性 条 带原 因 解 决 办 法底 物 太 灵 敏 选 择 合 适 的 底 物交 叉 反 应 选 择 单 克 隆 抗 体抗 原 浓 度 太 高 降 低 抗 原 浓 度抗 体 浓 度 太 高 降 低 抗 体 浓 度曝 光 时 间 太 长 减 少 曝 光 时 间其 他现 象 原 因 解 决 办 法荧 光 萃 灭快二 抗 浓 度太 高膜
21、 干 燥降 低 二 抗 浓 度保 证 膜 的 湿 润 度条 带 内 出现 不 显 影 圆 点转 膜 过 程中 有 气 泡转 膜 时 赶 尽 气 泡条 带 不 完整底 物 孵 育不 均 匀用 保 鲜 膜 均 与 孵 育 底 物反 影 （ 白色 条 带 、 黑 色背 景 ）HRP 浓度 过 高降 低 二 抗 浓 度散 在 小 圆斑封 闭 液 有杂 质 颗 粒静 置 牛 奶 使 大 颗 粒 沉 淀推 荐对 照 设 置内 参 照 beta-actin /beta-tubulin/GAPDH阳 性 对 照 检 测 一 抗 是 否 正 常阴 性 对 照 检 测 一 抗 特 异 性空 白 对 照 不 加 一 抗 ， 只 加 二 抗 ， 检 测 二 抗 是 否 发 生交 叉 反 应F 全球抗体搜索引擎，您身边的抗体专家全球抗体搜索引擎 (http:/) 成为继基因数据库、蛋白数据库之后出现的网上公共数据资源库新成员。这项计划通过建立多达 40 多万种的精准抗体，整合了全球 80 多家研究机构和抗体供应商的抗体数据，涵盖 200 多物种，包括Abcom、AssaybioTech、Abnova 等一线知名品牌
