1、Western blot 操作步骤实验原理：Western blot，也称 Western blotting、蛋白印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如 PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
2、该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。内参: WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准；最重要和最不可或缺的对照就是内参照。1.内参可检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的；2、起半定量的标准的作用，内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；内参名称 分子量大小 适用范围beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒
3、体COXIV 16kDa 线粒体TBP 38kDa 细胞核实验步骤一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）第一步：法（ 1）敲取 0.07-0.1g 组织+400-500ul 裂解液，放入打样管，放入打样机打样。法（ 2）实验室研钵研磨：取稍大于 0.1g 的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。第二步：取出的样品放置冰上 1-2h（中间混匀 5-6 次）直至裂解完全。第三步：样品离心2 ，取上清于新的 EP 管中。（离心条件：13000rpm，4，30min）注：离心机提前预冷至 4。二
4、、蛋白含量的测定第一步：在 96 孔板第一列 1-8 分别为浓度为 0，1，2，4 ，6，8，9 ，10 倍的蛋白标准液+ 水=10 或 20ml，再加上 5 倍稀释的考马斯亮蓝染液 200ml。第二步：在 96 孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液 10-20ml 以及 5 倍稀释的考马斯亮蓝染液 200ml。注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。三、电泳第一步：清洗玻璃板将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。第二步：配胶（1 ）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （2 ）配分离胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻
5、璃板 3/4 位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝固更快。注：加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。（3 ）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。注：插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。（ 4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）第三步：上样（1 ）测完蛋白含量后，计算含 50mg 蛋白的溶液体积即为
6、上样量。适量蛋白加入 4：1 5Loading Buffer 于离心管，100水中煮 5min 使蛋白变性。放置冰上 3min，离心15min，13000rpm，4 。（2 ）加足够的 1电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要没过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）第四步：电泳浓缩胶 80V 电压跑 20 分钟，至蛋白 marker 分离即可加压，也可多跑几分钟；分离胶120V 电压跑至底端。第五步：停止电泳纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在 Marker 下
7、方切角做标记，将胶泡在清水中。四、转膜（跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡）第一步：剪 PVDF 膜，并提前切角标记方向，甲醇中泡 1-3min。第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入 1转膜液中，放 4保存。第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。) 在垫子上垫 2 层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上完全对齐，并除气泡。在膜上盖 2 层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在 4的 1转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的
8、滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。第四步：将夹子放入转膜槽中，黑对黑，白对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。注：转膜条件是电流 300mA 或电压 70V，2h；另一个约束条件就是电压必须控制在 60-70V，调节电流。第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加 5%的封闭液，摇床封闭 1h。五抗体孵育，免疫反应第一步：回收封闭液，加入一抗，摇床 30min-1h，4过夜，再孵育 30min-1h。第二步：一抗回收，用 PBST 洗，洗 5 次，每次
9、5min。第三步：加二抗，孵育 2h。第四步：二抗回收，用 PBST 洗，洗 5 次，每次 5min。第五步：纯水冲洗 5-7 次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡 2-3min，成像。实验药品试剂1.裂解液：母液（动物组织蛋白提取 Buffer）：蛋白酶抑制剂：Pmsf （配）=100:1:1母液常温放置；蛋白酶抑制剂和 Pmsf 需-20保存；裂解液需-4保存。2.考马斯亮蓝染液，使用前用无菌水稀释。3.转膜液的配制（1）1L试剂 剂量Tris 3.028gGlaline（甘氨酸） 14.4gSDS 1g先定容 800ml，调制 PH=8.3，然后+200ml 甲醇，混匀。4.蛋白
10、电泳 Buffer（5）1L试剂 剂量Tris 15gGlaline（甘氨酸） 72gSDS 5g直接定容至 1L，无需灭菌和调 pH；使用前稀释至 1。5.磷酸盐缓冲液（PBS，10 ）500ml 试剂 剂量NaCl 40gKCl 1gNa2HPO42H2O 7.2gKH2PO4 1.2g调制 pH=7.4-7.56.PBST 配制1L 的 PBS+5ml 20%Tween207.封闭液（5%）脱脂奶粉 5g，溶于 PBST，定容至 1L。8.一抗溶于封闭液；二抗溶于 PBST。9.按照如下表格配制 SDS-PAGE 的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶、上层胶)成分 配制不同体积 SDS-PAGE
11、 浓缩胶所需各成分的体积（mL）5%胶 2 3 4 6 8 10蒸馏水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.830%Acr-Bis(29:1) 0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.71M Tris，pH8.8 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.2510%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.110%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.0110.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶（下层胶）浓度SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳
12、分离范围6%胶 50-150kD8%胶 30-90kD10%胶 20-80kD12%胶 12-60kD15%胶 10-40kD成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）6%分离胶 5 10 15 20 30 50蒸馏水 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.030%Acr-Bis(29:1) 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.01M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0
13、.004 0.008 0.012 0.016 0.024 0.04成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）8%分离胶 5 10 15 20 30 50蒸馏水 1.7 3.3 5.0 6.7 10.0 16.730%Acr-Bis(29:1) 1.3 2.7 4.0 5.3 8.0 13.31M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.018 0
14、.03成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）10%分离胶 5 10 15 20 30 50蒸馏水 1.3 2.7 4.0 5.3 8.0 13.330%Acr-Bis(29:1) 1.7 3.3 5.0 6.7 10.0 16.71M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成
15、分的体积（毫升）12%分离胶 5 10 15 20 30 50蒸馏水 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 10.030%Acr-Bis(29:1) 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.01M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02成分 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积（毫升）15%分离胶 5 10 15 20 30 50蒸馏水 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.030%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.01M Tris，pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.010%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.510%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
