1、 蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。A 第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定 WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度
2、、表面活性剂、还原剂等的选择）；3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5. 样品分装，长期于-80中保存，避免反复冻融。方法的选择 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ； 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1. 提前一天 4解冻 RIPA，一定要完全融化；配 PBS（用于细胞试验则需高压） ；2. 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF 终浓度为 100mM（根据样本数配制所需
3、的量，临用临配） ；3. 裂解组织：每个样品称取 100mg，加 1ml 裂解液，匀浆后 4静置 2h 使其充分裂解，14000g，4离心 10min，取上清。4. 蛋白定量：取少量上清稀释 30 倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用 Bradford 法，可以选用改良的 Lowrys 法或者 BCA 法。5. 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入 PBS 稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为 3mg/ml。6. 分装并存于-80，避免反复冻融。B 第二部分：相关试剂的配制：1. 10%的
4、SDS（戴口罩称取）：称取 SDS10g，先加双蒸水 80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在 50水浴溶化后，仍可使用。2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 8.8，最后定容至100ml，室温下保存。3. 0.5M Tris/HCL（pH6.8）Trisbase 6.06g，溶解于 80ml 双蒸水，用浓盐酸调 pH 至 6.8，最后定容至100ml，室温下保存。4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N-亚甲丙烯酰胺 丙烯酰胺（Acr） 75g甲叉双丙烯酰胺
5、 2g加双蒸水 150ml，37加热溶解后，定容至 250ml，查证该溶液 pH 应不大于7.0，4棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。Be careful!：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和 N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。5. 上样缓冲液0.5mM Trisbase(pH6.8) 2.5ml甘油 2.0ml10SDS 4.0ml0.4%溴酚蓝（mw669.97） 1ml二巯基乙醇（mw78.14） 0.5ml注：配好后分装-20保存。6. 电泳缓冲液10 倍储存液 1
6、倍应用液Trisbase 30g 3g甘氨酸 144g 14.4gSDS 10g 1gComment l1: (不调 PH亦可用，为什么？)加水至 1000ml，PH 值用 HCl调 8.3。已经配制了 1000ml的储存液。电泳缓冲液用应老师的电泳槽应用液 300ml。用 10倍的储存液 30ml加入水 270ml。7. 转移缓冲液（临用临配，铁盒子里搅拌混匀并 4预冷）：Tris base 甘氨酸 H2O（ml） 甲醇（ml） 终体积（ml）0.606g 2.88g 160 40 2002.424g 11.52g 640 160 8002板胶转移缓冲液的用量约为 200ml。8. 洗涤缓冲
7、液（TBS）10倍储存液 1倍应用液Tris base24.2g 2.42gNaCl 80g 8g加水 800ml，用 HCL调整 PH为 7.6，再加水至 1000ml，已经配制了 1000ml的 TBS液，临用时再加 0.1%的 Tween-20。一般做两板胶要用洗涤缓冲液 500ml；用储存液 50ml加入 450ml水，后加 0.5ml Tween-20。9. 封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）10ml/膜脱脂奶粉 2g洗涤缓冲液 40ml两板胶 4张膜要用封闭缓冲液 40ml。具体实验步骤：准备：准备器材：10%过硫酸铵；冰盒；预热恒温加热器；拿出试剂（双丙和TEMED提前从冰箱拿出平衡，否
8、则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡） ；电泳仪器；洗干净的板子和梳子；滤纸条用于吸水；剪刀；尺子；剪好的膜（根据目的蛋白分子量以及样品个数决定）及比膜稍大些的干净滤纸；脱脂奶粉；干净的装封闭液的容器约 50ml 大小；提前清洗玻璃板并晾干：注意不要用清洁球之类的粗糙物品清洗玻璃板，可用洗洁精泡约 2h，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，置于架子上晾干。做胶分离胶：1. 先称取过硫酸胺，配两板胶用 10的过硫酸胺 150l，一般要称取过硫酸胺0.2-0.3mg，溶解到相应量的双蒸水中，混匀。分离胶（括号里为 2 板胶的用量）试剂 7.5 10 12 15水(ml)
9、4.9 (7.35) 4.1(6.15) 3.4(5.1) 2.4(3.6)(ml) 1.5MTris/HCl(pH=8.8)2.5(3.75) 2.5(3.75) 2.5(3.75) 2.5(3.75)丙/双丙烯酰胺 2.5(3.75) 3.3(4.95) 4.0(6.0) 5.0(7.5)10%SDS 100,(150) 100,(150) 100,(150) 100,(150)10%过硫铵(l)50,75 50,75 50,75 50,75TEMED 10,15 10,15 10,15 10,15适用蛋白分子量 100kDa 60-100kDa 20-60kDa 20kDa玻板间夹上胶条
10、，用夹子将两块玻板夹紧。按以上方法配胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，将胶加入到玻璃板的夹层中。加入的量略高于夹子的最高处（或者胶面升到绿带中间线高度时即可）加好后加入 1ml 的水压胶。做分离胶时，凝固时间大约为 2540 分钟，要根据温度来确定。一般可以依据剩下在离心管中的胶的凝固情况来确定胶的凝固。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。注意： 旧的 1.0mm 的板子短的玻璃在里面，新的在外面。 过硫酸铵一般现配现用。 注意各种试剂加入的顺序， “三大三小”
11、，后面加过硫酸铵，最后加TEMED。 配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。 要根据温度调整 TEMED 的使用量。夏天凝结的快，冬天凝结的慢。冬天如果凝结的慢，两板胶可以加 TEMED 20-30l。 水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平，封胶后切记勿动。 胶通常在 0.51h 内凝集最好，过快胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。下一步实验准备a 准备样品：1 预热微量恒温器（98） ；2 准备一套中 EP 管并标记，以用于混匀样品和上样缓冲液；3 取出样品，marker ，上样缓冲液置于冰上；4 样品：上样缓冲液=3:1 混匀，置于微量恒温器上 98 5min
12、变性；b 配制电泳缓冲液；c 配 4浓缩胶， TEMED 临用时加。浓缩胶（括号里为 2 板胶用量）水 3.00ml (4.5ml)0.5MTris/HCl(PH=6.8) 1.25ml (1.875ml)丙/双丙烯酰胺（30%/0.8%）0.67ml (1.005ml)10%SDS 50l (75l)过硫酸胺（10） 50l (75l)TEMED 5l (15l)胶凝固后，迅速向上将梳子拔下，将玻璃板夹上电泳架，完整的玻璃板在外围。电泳槽中倒入电泳缓冲液（约 300ml） 。加足够的电泳液后开始准备上样。 （电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板） 。注意：浓缩胶的加入很重要，由于其硬度比分离胶小，
13、而且还要加入梳子，掌握其凝固的时机很重要。太迟胶要粘住梳子，太早胶凝固不好。用 Bio-Rad 的玻璃板用TEMED 15l，在温度为 22时凝固的时间为 10 分钟左右，温度再高一些可以达到 89 分钟，低一些可以延长一些。胶的凝固很快，主要是加入 TEMED 后的动作要迅速，以免在离心管中凝固了。加入的量要与玻璃板的最高线平行。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补 12 次就行了，不补胶问题也不大） 。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子
14、的两边竖直向上轻轻将其拔出。插梳子要用力均匀，一次成型，且要注意梳子插入时哪面朝内哪面朝外。加样（加变性后的样品）：用微量进样器或加样吸头吸入样品 20l，加入到加样孔中。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出时不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。 （加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。 ）加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。在第一孔和最后一孔加 20l 上样缓冲液以避免边缘效应，第二孔加 3l marker，其他孔加 20l 样品（样品加样 20-30l 都可以，但不超过 30l,加样量取决于蛋白浓度） ，保证每个上样孔蛋白
15、浓量为 30-50g。电泳：100V，电泳 2 小时，电泳时要注意电泳槽上的电泳缓冲液的量，较少时，要从下槽中吸取一部分转移到上槽。有时电泳的时间用不到 2 小时，要依据溴酚蓝的位置确定是否要停止电泳。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。转膜：蛋白因结合 SDS 而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100 kDa 的蛋白。要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。 （撬时一定要小心，胶很易裂，要用
16、巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作） ，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶， （膜盖下后不可再移动）并去除气泡。准备：1. 电泳期间，剪好滤纸和膜，宽度由 marker 及目的蛋白分子量确定，长由加样孔数决定；2. 配置转膜缓冲液并预冷；3. PVDF 膜用甲醇活化（目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的） 。 半干法转膜：电泳完毕后，用卡片从一角的缝隙撬下一块玻璃板，注意用力适度，用刀将没用的胶切除：浓缩胶，加样孔
17、以外的胶，和溴酚蓝下方的胶。先将 PVDF 膜和海绵泡在转移缓冲液中，将 PVDF 膜做好标记：剪刀剪下其一边的两角，一大，一小。将上述东西置于半干转膜仪器上， “三明治”从下往上的顺序依次是：（）滤纸- 胶 -膜-滤纸（） 。用电转缓冲液稍微润湿，转膜 100mA 1.5h。注意防止转膜时电源插反。 湿法转膜：“三明治”从下往上的顺序依次为：()海绵-滤纸-胶-膜-滤纸- 海绵()，三明治安放的方向确认正确，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）的电迁移。100mA 转膜一个半小时即可。夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。蛋白带负电，膜要靠近
18、正极Comment l2: 比如半干转膜时拿出的要反过来封闭，在后面洗脱，孵抗体，显影时都是正面朝上注意：1.避免用手直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；2.用卡片把玻板撬开时注意用力要轻以免损坏玻板；3.把胶从玻板上剥离时要保持胶的完整性，以及胶和膜之间不能有气泡。若有气泡则可用小玻棒轻轻滚下赶走气泡；4.滤纸胶膜之间的大小，一般是滤纸膜胶。5.转膜前要在转膜缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍于转膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。封闭：转膜完成后，将膜从转膜夹中取下，将膜用 TBS从下向上浸湿后，移
19、至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1h。注意要将贴胶的一面朝上（正面）的放在封闭盒子中，加入封闭液。4过夜。注意：如果选用 AP作为显色方法，封闭时就要选择 Tris缓冲系统，不要用PBS，因为 PBS滋扰 AP。洗脱（10mim/次，洗脱 3 次）：第二天，将封闭液倒掉，加入洗脱缓冲液，室温下摇 10 分钟，倒掉；再加入洗脱缓冲液，室温下摇 10 分钟，倒掉；加入洗脱缓冲液，摇 10 分钟，倒掉。一抗孵育：准备： 拿出配制抗体的新管子并标记（抗体名称，稀释比例，配制日期及所有人） ； 抗体的稀释：用洗脱缓冲液稀释 eg.1:200，则 10l 加 2ml 洗脱缓冲液； 一抗原液
20、用之前要 12000rpm 离心 20s 或者用手轻弹使蛋白混匀。步骤：加入一抗每小盒 2ml（皿用 5ml） ，室温下摇动孵育 2 小时。2h 后回收一抗。洗脱：步骤同前（10mim/次，洗脱 3 次） 。二抗孵育：准备： 拿出配制抗体的新管子并标记（抗体名称，稀释比例，配制日期及所有人） ； 二抗的稀释直接依照稀释倍数用洗脱液稀释； 二抗原液用之前要 12000rpm 离心 20s 或者用手轻弹使蛋白混匀。步骤：加入二抗每小盒 2ml（皿用 5ml） ，室温下摇动孵育 2 小时。1h 后回收二抗。洗脱：步骤同前（10mim/次，洗脱 3 次） ，注意洗第三遍后，不要立即将洗脱缓冲液倒掉。显
21、影：辣根过氧化物酶 HRP-ECL 发光法：1) 配置显影液：2 张膜配 A 和 B 液各 700l 并混匀。2) 准备 U 盘或者刻录盘，1000 枪，枪头，篮子，方盖子，镊子，滤纸，1.5EP 管，显影液。3) 将膜从盒中夹出，滤纸贴角吸干，正面朝上平整的放在方盖子里，将显影剂用枪打到膜上，尽量不要让膜在盒子里挪动，均匀的在膜上浇显影液35min，倒掉显影液，并用滤纸拭干周围。4) 把膜放入机器（正面朝上） ，打开电脑，snap 软件，此时再推进机器，按钮变成蓝色，界面中间部分有 2 个图标，左边为单个拍照，时间在其下调试；另一个为连续拍照，点击图标后输入曝光时间（推荐 30s，可跟据试剂
22、情况延长到几分钟） ，3 次即可，显影后，另存为 As，再保存张 export as TIFF 格式。AP-NBT/BICP 显色法：原理：本试剂盒采用 BCIP 和 NBT 为底物，可由标记于二抗上的 AP 催化，产生化学显色反应 ，在蛋白转印膜阳性蛋白条带处形成蓝紫色沉淀，适用于使用 AP 标记抗体的 Western blot。与化学发光类试剂相比，本产品使用方便，可快速获得结果；但检测灵敏度不及化学发光类试剂。使用方法：用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的漂洗液；正面朝上平整的放在干净的方盖子上，将显影剂用枪均匀浇到膜上，尽量不要让膜在盒子里挪动，并用不透明物体（如
23、报纸）遮挡光线，室温孵育 515min，显色 20s后每 10s 观察一次，至条带明显或有本底出现时用蒸馏水洗涤 12 次即可终止显色反应，放滤纸上晾干即可观察与扫描。WB 过程中常见的问题及可能原因分析 问题 可能原因 验证或解决办法膜没有完全均匀湿透 使用 100% methanol 浸透膜靶蛋白分子量小于 10,000 选择小孔径的膜，缩短转移时间靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如CAPS 缓冲液（pH 10.5)或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子
24、量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替转膜不充分转移时间不够 Thick gel 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间膜没有完全均匀湿透 使用 100% methanol 浸透膜洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数阻断不充分增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）二抗浓度过高 降低二抗浓度检测过程中膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象背景高曝光过度 缩短曝光时间抗体与阻断蛋白有交叉反应检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间酶失
25、活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。试剂不匹配一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性一抗失效 选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液没有阳性条带HRP 抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间酶活性降低直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物标本
26、中靶蛋白含量太低 增加标本上样量。洗膜过度 缩短洗涤时间有阳性条带，但条带比较弱HRP 抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠抗体活性降低选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置蛋白转移不充分 见上述封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型曝光时间过短 延长曝光时间HRP 抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠二抗的非特异性结合增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）一抗的特异性不够使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性蛋白降解 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度抗体浓度过高降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带条带位置（大小）不对；或有非特异性条带蛋白上样量过大 降低上样量封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂背景有斑点HRP 耦联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，去除聚集体膜上出现反像（暗背景上白色带） HRP 含量过高 降低酶联二抗的浓度
