1、western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件WESTERN BLOT 操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳 灌胶：注意：Acrylamide（聚丙烯酰胺）剧毒，需戴手套操作。1、将玻璃板用清洗剂洗干净后，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗三遍（勿用酸泡） 。2、固定好玻璃板，配置分离胶溶液(10ml 两板，一板可以减半配制)根据分子量选择相应浓度的分离胶。胶浓度 超纯水 凝胶储备液Gel bufferPH8.810%SDS10%APSTEMED10%常用 4.1ml 3.3ml 2.5ml 0.1ml 50l 15l12%小分子量 3.4 ml 4.0 ml 2.5ml 0.1ml 50l 15l8
2、%大分子量 4.7ml 2.7ml 2.5ml 0.1ml 50l 15l3、用 1000l 移液器吸取分离胶溶液，缓缓灌入夹缝中，勿产生气泡，每板大约 4.5ml，灌完后再胶顶部加无水乙醇封闭。4、待分离胶凝固（约 40min）倒掉无水乙醇，用 超纯水清洗三次，用滤纸洗掉多余水分。5、配制浓缩胶溶液（10ml- 四板量，两板可减半配置） 。胶浓度 超纯水 凝胶储备液Gel bufferPH8.810%SDS10%APSTEMED5% 5.7ml 1.7ml 2.5ml 0.1ml 50l 20l6、灌浓缩胶，并插梳子。western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件7、室温聚合 30
3、-45min，将玻璃板固定于电泳槽内，倒入适量的 1电泳缓冲液，拔出梳子。上样，电泳上样：20l 移液器逐个加样， （第一道加 5RSB 小于 4l 和 Matker 4l,空泳道加5RSB 5l） 。加适量 1电泳缓冲液，接好正负电极。开始设置为 90V 恒压，观察 marker 的移动情况，尽量拉长自己感兴趣的区域，适时终止电泳。转膜。电泳： 1、将建勇后的胶取出浸入转膜液， （注意胶方向，做好标记）摇床缓慢摇30min。戴手套裁取 PVDF 膜(8.35.2cm) ，甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入转膜液中，至少 5min。将取下胶的玻璃板清洗干净2、用转膜液润湿一张厚滤纸，铺于半干转印仪的底层
4、电极版上，将PVDF 膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于 PVDF 膜上，不留气泡。3、润湿另一张厚滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡。4、盖上顶层电极板、接通正负极电源，15V( 不超过 25V )转印20min。5、配封闭液。western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件杂交1、 取出 PVDF 膜，和胶相邻面向上浸入封闭液置于摇床缓慢摇 1hr 以上。2、 倒掉封闭液，用洗膜液略洗一下，取 15ml 离心管，加入 5ml 杂交液。按适当比例稀释一抗(按说明书要求) ，管上注明抗体名称、来源、分子量和稀释比例。摇床上室温杂交 2hr 或 4C 杂交过夜。3、 取出 PVDF
5、膜，用 TBST 洗 3 次，每次 5min。4、 倒掉 TBST，把 PVDF 膜放入装有二抗的 15ml 离心管中，摇床上杂交 1hr。5、 取出 PVDF 膜，用 TBST 洗 3 次，每次 5min。ECL 反应1、 倒掉洗膜液，吸去多余液体，转膜时与胶相邻的一面向上，铺于玻璃板上。2、 将 ECL 试剂盒内的 detection reagent 1 与 detection reagent 2 等体积混合后，均匀滴在 PVDF 膜上，反应 1-2min。3、 上机检测。注意事项 大部分试剂有累积毒性，必须佩戴手套操作。 玻璃板贵且易碎，使用时轻拿轻放，用完刷干净放于板架上。 移液器使用
6、完调至最大量程放在枪架上。 梳子使用完拿水冲净。western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件 制胶架上的胶条，制胶完毕后需用水冲净擦干，用完放回原位。 半干转印仪使用完需拿纸擦干电极板。 实验完毕，实验台收拾干净，废液缸倒净，关闭仪器电源。试验方法（样品篇）1. 样品制备BCA 法测定蛋白质浓度BCA 蛋白测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit）是根据目前世界上最常用的两种蛋白浓度检测方法之一 BCA 法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。测定蛋白方法根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂（50：1
7、）配置适量BCA 工作液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。2. 完全溶解蛋白标准品，取 10 微升稀释至 100 微升，使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可用0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品。3. 将标准品按 0，2 ，4，8，12，16，20 微升加到 96 孔板的标准品中，加用于稀释标准品的溶液补足到 20 微升。4. 加适量体积样品到 96 孔板的孔中，加稀释标准品的溶液到 20 微升。5. 各孔加入 200 微升 BCA 工作液，37放置 30 分钟。注：也可以室温放置 2 小时，或 60 放置 30
8、 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果温度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件6测定 A562 或 540-595nm。根据标准曲线计算出蛋白浓度。7根据测定的蛋白浓度。按照上样要求制作样品。加入 RBS 和 TBS。完成后沸水煮5 分钟，零下 20 度可保存数月。WESTERN BLOT 常用液体配方 凝胶储备液 （30%Acer/Bise）Acrylamide 58gBise-acrylamide 2g加超纯水溶解（约 100ml）定容至 200ml，4 棕色瓶避光
9、保存 Gel buffer pH：8.8 (分离胶用)Tris-base 36.3g加超纯水溶解（约 100ml）用浓 HCL 调 PH 值至 8.8加超纯水定容至 200ml 4保存 Gel buffer pH：6.8 (浓缩胶用)Tris-base 12.1g加超纯水溶解（约 100ml）用浓 HCL 调 PH 值至 6.8加超纯水定容至 200ml 4保存 10%APS:过硫酸铵（APS） 0.1g加超纯水至 1ml新鲜配制，4可保存 10 天 10%SDS（十二烷基磺酸钠）SDS 10g加超纯水至 100ml 室温保存 10* TBSTris-base 61gNaCl 90g加超纯水溶
10、解，调 pH 值至 7.6定容至 1000ml 10*电泳缓冲液 （Running buffer）Tris-base 30.3gGlycine 144gSDS 10g加超纯水定容至 1000ml 转膜液 (1000ml)Tris-base 3.03gGlycine 14.4g加超纯水至 850ml，加甲醇 150ml 杂交液 （稀释抗体用）0.05g BSA加 TBST 至 500ml 4保存 TBST 转膜液1*TBS 1000ml（取 900ml 超纯水+100ml 10*TBS）加 Tween20 1ml 封闭液 （1%BSA ）0.4g BSA加 TBST 至 40ml，摇匀 必须现western bolt 实验操作步骤中心实验室内部文件用现配备注：凝胶储备液（30%Acer/bBise）剧毒，操作是请注意自带口罩，手套。TEMED 有刺激性气味，注意防护。10*液体为储备液，请稀释至 1*使用。
