1、1微生物研究法 研 D研一 曾仁志 94334002實驗目的：了解實驗室安全分級之基本原則，及生物安全櫃之類別。在生物安全櫃選擇上之考量及正確的使用方法，以確保自身之安全。並學習細胞培養時培養基之設計上的考量，如 pH 值之範圍(哺乳動物為何 ?昆蟲細胞為何?)、培養基之添加物的選擇、無菌操作技術等。以期在往後的實驗中，能思考培養基之設計上對細胞可能產生的影響為何?應如何去修飾以達較理想的生長環境。子題一、實驗室及生物安全櫃等級、無菌操作之不同的介紹實驗室等級：依據操作手續、實驗技術、實驗樣本、實驗室硬體、安全設備及對操作人員可能造成的傷害，基本上，實驗室可分為四級生物安全等級；然而各系統因針
2、對的實驗目的及要求不同而產生在分級的區別上有所差異；然而，在基本的共識上皆是針對避免生物性樣本、化學試劑等物質外逸造成人員健康上危害或為確保操作試驗物的潔淨所設計的。因此，以下我們茲就整各項資料，簡介如下：一級實驗室：最基本的安全防護措施，只能處理已被定性，對健康成人不引起發病的活微生物。二級實驗室：可進行中等風險的微生物操作(低傳染性，不經空氣傳播)，擁有初級屏障，例如：生物安全操作櫃、噴濺隔離板、面部防護設備等；洗手及廢棄物除污染設備均為必備；人員需穿著外袍及佩戴手套。三級實驗室：可進行嚴重及潛在性致命危險感染的，可透過氣體傳播的微生物操作，承擔的風險為可能空污感染的微生物；所有實驗室操作
3、均在生物安全櫃或其他密閉的設備中進行，實驗室之進出有嚴格管制，獨立的排氣系統，用以降低感染性空污的外洩。四級實驗室：通常是一棟分離的建築物或是一間擁有排氣及廢物處理系統，可防止活的微生物外洩至外界環境的大實驗室中的單獨隔離區；應在三級生物安全操作櫃中操作；穿著全身、正壓供氣性個人防護服。實驗室可進行海外來的，不知名的微生物或會引起個人高風險，對生命具威脅性的，目前無藥物及疫苗可用的微生物。生物安全櫃之分級：在生物實驗操作上、生物安全櫃為一保護研究人員免被生物性樣本、化學2試劑等物質外逸造成人員健康上危害，或為確保操作養本的潔淨之一基礎工具。更由於其選擇與使用的正確性與實驗室人員安全息息相關，因
4、此成為使用者極為重要的課題。在微生物學級生醫實驗室生物安全一書中，將各式安全櫃依適用的生物危害層級分為三級。應注意的是，各式安全櫃用以保證排氣乾淨的 HEAP FILTER 雖可以有效的阻止粒狀物，例如具感染性的病原媒介等，但無法阻止易揮發性的化學品或有機氣體，因此若操作物含易揮發性的有毒化學品時，應有適當的排氣系統將氣體排出至外界；以下我們茲就國際上生物安全櫃的種類分級作一簡略的介紹。(1)第一級安全櫃第一級安全櫃結構設計如圖 1 所示，其使用目的在於保護人員及環境，但並不提供對櫃內操作物種（實驗試料、產品等）的潔淨保護。櫃體在排氣口處設有 HEPA FILTER，以避免安全櫃內操作物質未經
5、處理排出後污染環境。而在操作人員保護方面，生物安全櫃主要是藉櫃體內的氣體流場來進行操作物與人員的隔離，因此在操作區需保持最小的送風速度至少應達到 0.38 m/sec (75 ft/min)。由於無法提供櫃內操作物種的潔淨保護，目前各生技相關產業中第一級安全櫃的使用已逐漸減少，多為被用於密閉的設備，如離心機、小型發酵機或伴隨有潛在產生大量氣膠的製程中使用。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。圖 1 第一級生物安全櫃構造圖A. 視窗開口(front opening) B. 視窗(sash)C. 排氣 HEPA FILTER(exhaust HEPA filter
6、)D. 排氣室(exhaust Plenum)3E. 工作臺面F. 格狀開口(grille)(2) 第二級安全櫃第二級安全櫃結構設計如圖 2 至圖 5 所示，型式分為 A1、A2（原 B3）、B1、B2，主要針對無菌的動物組織、細胞培殖與病毒繁殖的試驗操作，因此安全櫃需提供櫃內操作物的潔淨保護。其防護原理是以櫃內層流配合 HEPA FILTER 的使用來提供一個無菌的操作環境，此級安全櫃可提供人員、環境及產品三層面的保護。安全櫃運轉時，氣流經前方開口由外界引入於操作區內，用以保護人員不受操作物逸散的污染，流入操作區的外氣隨即被風壓引導流入循環室，以不流經過試料為原則，藉以保護試料產品的安全。排
7、氣則需通過 HEPA FILTER，可以被再循環回實驗室裡（型式 A 的安全櫃）或被排出至建築物外（型式 B 的安全櫃）。而後，流經HEPA FILTER 到操作區的氣體流場需提供試料保護、隔離外氣及排出氣膠的功能，以將安全櫃工作臺面的交叉污染減到最低。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。1.第二級，型式 A 安全櫃：又分為 A1 及 A2 兩種，兩者結構極為相近，不同在於 A1 安全櫃要求風機在安全櫃所應提供於視窗開口氣流速度最小量或量測平均量應至少 0.38 m/sec (75fpm)，而 A2 安全櫃要求則為 0.5m/sec，且 A1 由於風機位置置於
8、櫃體下方，造成櫃內通道皆處於正壓型態，若櫃體構造有所破損時，極容易造成洩漏而污染實驗室環境。型式 A 安全櫃氣體的循環比一般為 30%經排氣口 HEPA FILTER排除、70%通過回風 HEPA FILTER 再循環回到工作區，大部分此類型安全櫃設有調節閥，可以調整 30%與 70%的氣流分配。另外應注意的是，無裝設排氣導管的 A 型式安全櫃不可使用在易揮發性或有毒化學物質的實驗上，若排氣有污染環境之虞時，應使用可拆卸式的套管環繞氣罩部分，將排氣排出建築物外，且排氣流量必須足夠維持安全櫃操作面進氣與 HEPA 排氣間的氣體流動。4圖 2 第二級 A1 型生物安全櫃構造圖A. 視窗開口 B.
9、視窗C. 排氣 HEPA FILTERD. 供氣 HEPA FILTER(Supply HEPA filter)E. 後氣室(Rear plenum)F. 風機2.第二級，型式 B 安全櫃：又分為 B1、B2 兩種，此類型第二級安全櫃發源自國際癌症學會(National Cancer Institute)，其被設計用來進行玻璃試管內的操作微量危險化學品，與型式A 安全櫃最為不同的地方在於其一定直接或接管於室外排氣，同時回風比例亦較形式 A 低，即大部分使用後氣流不再過濾循環使用，甚至 B2 為完全無循環氣體使用。一些生物醫療的研究需要使用到小量危險的化學製品，如致癌化學蒸汽等，這些物質應當被操
10、作在穩定的氣流區間（如層流空間）以隔離人員，並在操作區的排氣導管中連結氣罩並過濾至建物排氣系統中釋放。B1 型式的安全櫃具有附加的 HEPA FILTER 以消除由操作區產生的微粒與化學物質對下游風機的污染。操作區的下吹氣流至少需達 0.5 m/sec 或以上，氣流到工作檯面分離後應有 70%的氣體流入後方格狀開口的設計條件，其餘 30%5的氣體(含外氣流入部分)進入前方格狀開口的回風室中。該型式安全櫃必須連結排氣導管，最好有與空調排氣系統分離的專屬的排氣系統，建議建物的排氣系統中具備獨立的壓力監視器，在排氣端應裝設失效警鈴，並由安全互鎖裝置連接安全櫃以切斷供風扇電力。其結構設計上另有 Ben
11、ch Top 型，就是設計將風機安裝於安全櫃上方(圖 5 )，同樣可提供與基本型相同的保護。型式 B2 的安全櫃為 100%排氣，無再循環使用，供氣需達操作區的下吹氣流至少 0.5 m/sec 以上，當試驗中使用的化學藥品會侵蝕 HEPA 濾材、框架等物件時，可考慮使用此類型以減少迴風濾材上的消耗。為了維持嚴格的安全操作方式，實驗室人員使用型式 B 的安全櫃進行試驗時，連結安全櫃排氣導管的排風風機應連接至緊急的供應電源，目的在斷電下仍能有足夠電力排出危害氣體至排氣系統中，避免洩漏進入實驗室造成人員危害。(3)第三級安全櫃第三級的生物安全櫃結構設計如圖 3 所示，其使用時機在於操作被歸類於生物安
12、全第四級的微生物試劑，通常安裝於已經管制出入、特殊通風或特殊防護系統的最嚴格污染控制實驗室內。安全櫃的內部需為一個漏氣率低於 10-5ml/sec 的封閉空間，並含一個封閉的觀察視窗，對於試料在此封閉的安全櫃是採取通過一浸水槽（可穿過安全櫃臺面）或雙層門的開口箱（如一雙門滅菌鍋）方式進出。此型式安全櫃的供給與排出氣體均需經過 HEPA FILTER 過濾。對外排氣時，氣壓應受安全櫃外部的專用獨立排氣系統所控制，以保持安全櫃任何時刻均在負壓狀態下，負壓值通常約為 0.124 kPa。此類型安全櫃的實驗操作為利用附加於安全櫃窗口的密封橡膠手套進行，以避免使用者直接接觸危險的物質。6圖 3 第三級生
13、物安全櫃構造圖（本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）A. 手套端的 O 形環(glove ports with O-ring for attaching arm-length gloves to cabinet) B. 視窗C. 排氣 HEPA FILTERD. 供風 HEPA FILTERE. 兩頭型滅菌鍋或傳遞箱(Double ended autoclave or pass-through box)Note:在安全櫃中化學浸泡槽應被裝置在工作臺面之下。三、生物安全櫃之選擇與使用生物物安全櫃對人員、環境與操作物所提供的保護依其等級不同而有所差異，表 1 為上述三種等級安全櫃之特性列表整
14、理，包括了最為基本的操作面速度要求、適用物質型態等，而表 2 則為使用場所的生物安全等級與應選用安全櫃等級的對照表，可供使用者作一快速比對參考。表 1、各型式生物安全櫃的特性比較適用型態安全櫃等級操作面風速（m/sec）空氣流動型態 非揮發性有毒化學品及放射性物質揮發性有毒化學品及放射性物質I 0.38排氣經由 HEPA FILTER 連結排氣系統到建物外面或經由HEPA FILTER 進入房間可 可II, A1 0.3870%經過 HEPA 再循環至工作區30%利用平衡閥經由 HEPA 經由導管排至外界可（微量） 否II, A2（B3） 0.50循環機制同 A1排氣管路與氣室、循環管道需設計
15、為負壓可 可（微量）II, B1 0.5030%經過 HEPA 再循環至工作區 可可（微量）770%利用平衡閥經由 HEPA 經由導管排至外界安全櫃之排氣需經由專用導管排放至外界且必須通過 HEPA FILTERII, B2 0.50無循環氣流，所有排到外界的氣體需通過 HEPA FILTER 可可（小量）III N/A 排氣口處需經兩個過濾器處理 可可（小量）表 2、生物安全櫃等級的選擇所能提供的保護實驗室生物安全等級(Biological safety Level, BSL)應選用的安全櫃等級 人員 試品 環境1 3 I 可 否 可1 3II（A1,A2 B1,B2）可 可 可4 III
16、可 可 可生物安全櫃操作注意事項(1)使用前準備在於安全櫃工作之前，應事先準備一份物料需求清單，並將所需要的物料儘可能的先置於安全櫃內，以使在安全櫃內的手部移動次數能減到最小，且為避免因為手臂移動破壞櫃內脆弱的空氣屏障，減弱安全櫃之保護性能，移動時動作不宜過快，方向儘可能垂直於開啟門的表面。開始工作之前應先以 70%酒精擦拭操作檯，同時於操作前開啟安全櫃內的抽氣機至少 3 至 5 分鐘以淨化安全櫃內殘留氣膠或微粒，操作人員應穿著實驗衣並配戴橡膠手套以保護手部，手套必須戴超過實驗外衣的袖口，調整坐椅高度至臉部高於安全櫃前端對外開口。為避免放置於安全櫃內的器具或試料造成櫃內氣流的干擾而引起防護氣流
17、的失效及交叉污染效果，因此多餘的用品應置於櫃外，櫃內只應有工作期間所需要的物品。此外，物品擺置應盡可能於操作檯面後半段，且須遠離兩端的格狀開口，容易產生氣膠的藥品或設備（如混合器、離心機等）應置於臺面的最遠端，試驗樣本等擺放則主要以使供氣氣流由低污染流向高污染試料區為原則。8(2)使用中操作所有操作必須在前方格狀開口後緣至少 10 公分處進行，具有潛在危害的物質應事先經過消毒處理程序或密封後無外洩之虞後才能移出櫃外，安全櫃操作者應受過安全訓練或具有良好微生物處理技術與經驗，以降低操作者暴露於傳染性疾病樣本的潛在危險。操作試驗時，打開的管子或瓶子勿以垂直的方式握住，研究人員進行組織培養皿有關的工
18、作時應握取無菌面上方的蓋子以減少向下氣流的直接衝擊，打開的容器應儘速在將其關閉，以減少交叉感染的機會。在安全櫃應儘能避免進行物質燃燒的操作，因火焰會產生自然對流使層流受嚴重干擾而造成污染的擴散，因此如種菌時接種環滅菌等需火源動作，可考慮以一種接觸平面式(touch-plate)的微燃燒器取代。(3)使用後清潔受污染的物料以櫃中預置的生物污染防治袋收集後密封，再移置滅菌設備殺菌後丟棄，生物櫃操作臺面、櫃體內壁及視窗內部玻璃則以 70%濃度的酒精或是用 1:100 稀釋的家用的漂白劑加以擦拭，或是使用針對某些特別試驗操作所使用的其他消毒劑清潔之，當使用漂白劑時，最好再以無菌水（sterile wa
19、ter）進行次清潔擦拭，以避免殘留下來的氯造成不銹鋼表面腐蝕。若試驗中不慎污染了安全櫃前後的格狀開口，則整個清潔工作必須包括櫃內所有物品及安全櫃內部，而在執行傳染性病菌的試驗工作後，更換 HEPA FILTER 或進行內部維修工作前則必須先進行 HEPA FILTER 的清潔工作，最常使用的方法為使用甲醛（formaldehyde）進行整個櫃體的燻蒸殺菌。子題二、培養基的配法，無機鹽、胺基酸，血清等成份介紹培養基之配製 (Medium Preparation)培養基在組織培養中扮演極重要的角色，它不僅提供細胞的生理(滲透壓、pH 等)和營養等細胞生存的環境需求，同時也提供細胞增殖所需的各種因子
20、，其中影響培養效果最大的是培養基中的血清。培養基種類(脊椎動物細胞培養用培養基)依其來源及製作方式的不同，基本上可分為天然培養基及人工合成培養基；天然培養基的物質來源主要為雞胚胎抽出液、蛋白質水解產物或酵母抽出物；但由於不同培養基的批號，對相同細胞可能會有不同的增殖效果，且取得麻煩；因此，目前所使用的培養基大部分為人工合成培養基，主要是鍵定天然培養基中促進細胞生長及增殖的成份再添加平衡鹽類溶液，在某一程度可取代天然培養基即稱之。培養基主要成份如下：(1)主要無機鹽離子(Na +、 K+、Cl -、Mg 2+、Ca 2+、 H2PO4-)9無機鹽離子為細胞生存不可缺少的分子，其個別的功能分述如下
21、：Ca 2+可增加細胞的吸附性、作為訊息傳遞分子；Na +、K +、Cl -，可調控膜電位；Mg 2+可安定細胞狀態；H 2PO4-與酸鹼值平衡有關，故為細胞內維持滲透壓、訓練傳遞及酸鹼值平衡有關，故為細胞內維持滲透壓、訊息傳遞及酸鹼值平衡等生理狀態，我們常會在培養基中加入無機鹽離子，而無機鹽離子的組成比例則會因培養條件的不同而不同，而細胞中許多合成反應上所需要 CO32-，則可由環境中空氣提供。(2)胺基酸(表 3)功能為提供細胞以合成核酸與蛋白質。人體只能新合成九種胺基酸。另有兩種胺基酸(Tyr 與 Cys)，則是利用這些所謂的必需胺基酸輔助合成的。由此可見所謂的必需或非必需，乃是以人體的
22、生合成能力來區分的。根據 H. Eagle 等人的研究，發現培養 HeLa 細胞時，還需要 serine 和pyruvate，並將這些物質稱為 population dependent requirement (PDR)。MEM 培養基中，可以發現大部分濃度較高的胺基酸都為必需胺基酸，在一些非必需胺基酸中，胺基酸過量反而會對細胞造成傷害，所以胺基酸的量不是越高越好。有些培養基中包括含有非必需胺基酸在內的 20 種胺基酸，以減少細胞的負擔，不需進行非必需胺基酸的合成。表 3、胺基酸濃度參考胺基酸 濃度 (mM) 備註L-Alanine 0.100L-Arginine-HCl 0.600L-Asp
23、aragine-H2O 0.100L-Aspartic Acid 0.100L-Cystine-2HCl 0.100L-Glutamic Acid 0.100L-Glutamine 2.000Glycine 0.100L-Histidine-HCl-H2O 0.200 非必需胺基酸L-Isoleucine 0.400 非必需胺基酸L-Leucine 0.400 非必需胺基酸L-Lysine-HCl 0.396 非必需胺基酸L-Methionine 0.101 非必需胺基酸L-Phenylalanine 0.194 非必需胺基酸L-Proline 0.100L-Serine 0.100L-Thr
24、eonine 0.403 非必需胺基酸L-Tryptophan 0.049 非必需胺基酸10L-Tyrosine-2Na-2H2O 0.199L-Valine 0.393 非必需胺基酸(3)維生素(表 4)常見所需的維生素 B 群，包括生物素、葉酸、菸鹼醯胺、泛酸、哆醇、核黃素和硫胺酸等 7 種；而一般培養基中不需要添加額外的脂溶性維生素，但脂溶性維生素可以和血清中載體蛋白作結合，而其結合的狀態則有助於細胞的吸收利用。維生素是維持細胞生長的一種生物活性物質，在細胞中大多構成輔酶，對細胞代謝有重大影響。表 4、Vitamins 個別功能：Vitamins 功能D-Ca Pantothenate
25、B3 傳遞 acyl groupsCholine chloride B4 形成 acetylcholine，傳導神經衝動。Folic acid傳遞一個碳的代替物，特別是 formyl 和hydeoxymethyl groups；DNA 中，提供 Methyl group for tjymine。i-Inositol 形成 IP3，作訊號傳導。Niacinamide 形成 NAD+、 NADP+，Oxidation-reduction reactions involving two-electron transfers。Pyridoxal HCl B6 Transfer of groups to
26、 and from amino acidsRiboflavin B2 Oxidation-reduction reactions involving one-and two-electron transfersThiamine HCl B1 Transfer of two-carbon fragments containing a carbonyl group(4)其他有機物、抗生素及酸鹼指示劑：於培養基中加入葡萄糖，主要的目的為提供能量及生合成各類細胞所需物質。葡萄糖可轉變成核酸及蛋白質。而為了防止細菌侵入，也可添加抗生素(表6)，惟其添加比例需過測試，否則會對細胞造成毒害。為了顯示培養基 pH 值，會加入酚紅作為 pH 指示劑，其變色範圍為6.88.3，環境偏鹼時顏色偏紅色，偏酸則為黃色，可以以此監控細胞培養時pH 值的改變並藉以做更換培養基的參考。例如細胞分裂過多時，釋出大量CO2，使環境偏酸，培養基呈黃色，可做為分盤的依據。當培養基有污染的情況下，培養基也會有顏色上的變化，因此可以藉由顏色瞭解培養基狀態。但有研究指出，由於結構式與固醇類化合物相似，可能與細胞膜上受器相結合，故酚紅可選擇性添加。
