1、Dot Blot 检测转基因小鼠肝内 HBV DNA 的可行性摘要 目的：考察dot blot检测HBV 转基因小鼠核酸指标的可行性。方法：用地高辛标记探针，检测杂交系统灵敏度，进行标准曲线研究，检测HBV转基因小鼠肝组织DNA样品。结果：杂交系统的检测灵敏度为0.g, 标准曲线R 2为0.98，可检测强度在标准曲线范围内的HBV DNA阳性信号。结论：优化后的 dot blot系统灵敏度高、特异性强、重复性好，可应用于转基因小鼠肝内HBV DNA检测。关键词 Dot Blot 转基因小鼠 HBV DNAHBV转基因小鼠是较理想的乙肝病毒复制模型，在抗病毒药物和治疗性疫苗的药效学评价中得到广泛
2、应用。Dot Blot是检测HBV DNA的方法之一，该方法常被用来检测乙肝病人血清HBV DNA，但刘建芳等研究提示，肝组织内的 HBV DNA比血清中的HBV DNA更能真实反映乙肝病毒复制水平。本研究旨在优化Dot Blot 条件，提高灵敏度和特异性，最终应用于转基因小鼠的肝内HBV DNA检测。1 材料与方法11 动物 HBV转基因小鼠，雌性， 8-10周。由本中心转基因动物研究室制备并饲养。12 试剂和仪器地高辛标记及检测试剂盒（DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II） 、尼龙膜购自Roche公司；X光片购自富
3、士公司；组织核酸提取试剂盒购自 OMEGA公司；其它试剂均为国产分析纯；5- ACGCAGGATAACCACATT-3，5-ACAACCTTCCACCAAACT-3引物由上海生工合成。 GAS7001B凝胶图像分析系统购自 UVItec公司；LF-III分子杂交炉购自宁波新芝生物科技股份有限公司。13 HBV探针的标记探针标记参照文献，采用PCR法标记。14 系统灵敏度的检测将含探针的质粒稀释成1000、100、10、1、0.1、0pg/l，沸水浴10min，冰水浴5min,各点1l于尼龙膜上，紫外线照射尼龙膜正、反面各3min进行样品固定，杂交、曝光。15 标准曲线的研究将含探针的质粒稀释成
4、100、50、25、12.5、6.25pg/3l,样品处理、点样、固定、杂交、曝光方法同灵敏度检测，各点3l。曝光后胶片经扫描用UVIBAND软件进行灰度值分析，以样品量及其对应的灰度值作曲线，考察线性关系。16 Dot Blot重复性及转基因小鼠均一性研究 取5只8-10周龄，雌性，乙肝表面抗原阳性的转基因鼠，体重分别为22.3g、25.5g、24.1g、24.3g和24g。分3次提肝组织总DNA ，测A 260凋整浓度为0.5g/l和1g/l，取10l点膜进行杂交，同时点标准品作标准曲线，点正常鼠DNA10g作为阴性对照。根据灰度值用标准曲线计算各样品的HBV DNA含量，比较同一只小鼠3
5、次杂交结果的重复性和各鼠之间HBV DNA含量的差异。 2 结果2.1 灵敏度检测 通过对杂交条件的调整，0.1pg质粒信号清晰可见(图1)。2.2 标准曲线的绘制 杂交后经扫描分析100、50、25、12.5、6.25pg的相对灰度值（把100pg设为100）分别为100.0、56.7、32.0、8.1和6.2，用两组数据作曲线，R 2等于0.98，线性关系良好。2.3 Dot Blot重复性和转基因小鼠均一性 5只转基因鼠，提肝组织总DNA，测A 260凋整浓度为0.5g/l和1g/l，分别取10l点膜进行杂交，根据灰度值用标准曲线计算各样品的HBV DNA含量。重复3次y = 0.9685x - 0.5697R2 = 0.98450204060801001200 50 100 150图1 灵敏度检测，0.1pg信号可见。 图2 标准曲线。A B图3 转基因鼠Dot Blot结果：（A）化学发光显色图。 （B）3次杂交 HBV DNA含量（pg/g总DNA）1000pg100pg10pg1pg0.1pg0pg100pg50pg25pg12.5pg-6.25pg10g 5g54321 54321正常鼠 0246810121 2 3 4 5HBV DNA(pg/ug)
