1、PCR 扩增反应一、实验原理PCR：是一种选择性扩增 DNA 或 RNA 的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA 半保留复制机理，以及在体外 dNTP 分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链 DNA 变成单链 DNA；单链 DNA 与人工合成的引物退火，以及在 dNTP 存在下，耐高温的 DNA 聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA。PCR 反应分 3 步：变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA； 退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA
2、，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP 底物及 Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应，以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达 21067 拷贝。图 反应历程变性退火延伸二、实验材料 1模板：细菌 DNA 2 TsgDNA 聚合酶 3dNTP 混合液410 倍浓度 PCR 缓冲液 52.5mmol/LMgCl2 6RAPD 引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S
3、97 S103 S110 S115 7提取细菌 DNA 的相关试剂 三、操作步骤 1细菌染色体 DNA 的提取（见上一组）2RAPD 反应体系的配置试剂 浓度 加入量10 倍浓度 PCR 缓冲液 2.5ul氯化镁溶液 2.5mmol/L 2.5uldNTP 混合液 各 2.5mmol/L 2.5ul上游引物 2.5umol/L 2.5ul下游引物 2.5umol/L 2.5ul细菌 DNA 2550ng 2.5ulTsgDNA 聚合酶 2.5U超纯水 10ul加 样 顺 序 总体积 25ul3反应程序：将 RAPD 反应试剂加入 EP 管中轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品
4、在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子打开 PCR 反应仪输入以下反应数据 94 摄氏度预变性 5min 94 摄氏度变性 40s 40 摄氏度退火 40s 72 摄氏度延伸 1min将 EP 管放入仪器开始扩增，循环 35 次；72 摄氏度延伸 10min 仪器为 Model MyGene 25 Plus 三、注意事项1、PCR 反应体系中 DNA 样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。2、为避免污染凡是用在 PCR 反应中的 Tip 尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂时都要换新的灭菌 Tip 尖。3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加 DNA 模板和 Taq DNA 聚合酶。4、置 PCR 仪进行 PCR 反应前，PCR 管要盖紧，否则使液体蒸发影响 PCR 反应。5.引物条件 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应（即错配） 。
