1、半定量 RT-PCR 的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品 RNA 的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30孵育 2 到 3 分钟。4下 12000rpm 离心15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA，混
2、匀后 15 到 30孵育 10 分钟后，于 4下 12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA 清洗 移去上清液，每 1mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1ml 的 75%乙醇（75%乙醇用 DEPCH2O 配制） ，清洗 RNA 沉淀。混匀后，4下 7000rpm 离心 5 分钟。 RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。 溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40l 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-80待用。2 RN
3、A 质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260 下读值为 1 表示 40 g RNA/ml。样品 RNA 浓度(g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA 溶于 40 l DEPC 水中，取 5ul，1:100 稀释至 495l 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取 5
4、ul 用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35 l，剩余 RNA 总量为：35 l 0.84 g/l = 29.4 g纯度检测RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g 琼脂糖溶于 72ml 水中，冷却至 60，10 ml 的 10 MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS 电泳缓冲液浓度 成分 0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 l 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1M
5、OPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备 RNA 样品取 3gRNA，加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至 70孵育 15 分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳 5min，随后将样品加入上样孔。5 6V/cm 电压下 2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 23cm。紫外透射光下观察并拍照28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型） ，上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和28
6、S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA 的降解表现为核糖体RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品 cDNA 合成反应体系序号 反应物 剂量1 逆转录 buffer 2l2 上游引物 0.2l3 下游引物 0.2l4 dNTP 0.1l5 逆转录酶 MMLV 0.5l6 DEPC 水 5l7 RNA 模版 2l8 总体积 10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。混合液在加入逆转录酶 M
7、MLV 之前先 70干浴 3 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5l，37水浴 60 分钟。取出后立即 95干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于-80待用。4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量 PCR -actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011，反应前取 3l 按10 倍稀释（加水 27l 并充分混匀）为 1010，依次稀释至109、10 8、10 7、10 6、10 5、10 4，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 阳性模板上游引
8、物 F 0.5l3 阳性模板下游引物 R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq 酶 1l6 阳性模板 DNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。管家基因反应体系：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10l2 内参照上游引物 F 0.5l3 内参照下游引物 R 0.5l4 dNTP 0.5l5 Taq 酶 1l6 待测样品 cDNA 5l7 ddH2O 32.5l8 总体积 50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93 2 分钟，然后 93 1 分钟，5
9、5 2 分钟，共 40 个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的 cDNA 模板进行 PCR 反应。反应体系：序号 反应物 剂量1 10 PCR 缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上游引物 F 0.5 ul4 下游引物 R 0.5 ul5 dNTP 混合液 3 ul6 Taq 聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。35 个 PCR 循环（941 分钟； 551 分钟；721 分钟） ； 72C 延伸 5 分钟。PCR 产物与 DNA L
10、adder 在 2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释 : 将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释: 设定 PCR产物浓度为 11010，依次稀释至 109、10 8、10 7、10 6、10 5、10 4 几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量 PCR 所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。体系配置如下：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq 聚合酶 2ul6 待测样品 cDNA 5ul7 ddH2
11、O 30ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。反应条件为：932 分钟预变性，然后按 93 1 分钟， 551 分钟，721 分钟，共40 做个循环，最后 727 分钟延伸。7 实时定量 PCR 使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 (即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR
12、反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的RNA 分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A)+选择性 RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行PCR。在一步法 RT-PCR 中，逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下，在一只管中顺次进行。 实验步骤：Trizol 法 RNA 提取步骤1、提取总 RNA2、逆转录反应3、PCR 反应
