1、三氧苯胺对泌乳素腺瘤细胞增殖及凋亡的实验研究摘要 目的 观察三氧苯胺对体外培养的垂体腺瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 将三氧苯胺作用于体外培养的泌乳素腺瘤细胞,测定 MTT 值,流式细胞仪测定细胞周期,TUNEL 法观察细胞凋亡情况。结果 低、中剂量的三氧苯胺对泌乳素腺瘤细胞增殖及凋亡无明显影响,高剂量三氧苯胺对泌乳素腺瘤细胞增殖及凋亡结论 高剂量三氧苯胺可明显抑制泌乳素腺瘤细胞的增殖并促进其凋亡。关键词 三氧苯胺 泌乳素腺瘤 细胞 增殖 凋亡材料和方法1 材料新鲜泌乳素腺瘤手术标本 21 例,其中男 12 例,女 9 例,术后经病理学检查确诊。2 主要试剂和仪器TAM、各种消化酶、MTT、胎牛
2、血清、DMEM培养基购自Sigma公司; 鼠抗人PCNA单克隆抗体试剂盒购自Santa Cruz公司 ,SP、DAB试剂盒购自北京中山生物工程公司。流式细胞仪为FACSort 型( 美国BD 公司产品)。3 泌乳素腺瘤细胞的分离和培养手术切除的泌乳素腺瘤(直径1cm左右) 即放入无菌 PBS中,4h内进行培养。将组织剪成的1mm 3小块,在0.5g/l胶原酶中消化至细胞分散,离散细胞混入含10%胎牛血清的DMEM培养基中。当单位体积的细胞数在510 8/L,接种96孔板、8孔载玻片及25ml培养瓶, 5%CO 2孵箱中培养。24h换培养液 ,以后48h更换一次。4 MTT试验培养至第8天更换无
3、血清DMEM培养液,24h后换含不同浓度的TAM (10 -9 mol/L, 10-7 mol/L, 10-5mol/L)5%胎牛血清培养液。孵育 24h后,每孔加入MTT20l,继续孵育4h后离心弃上清,每孔加入二甲基亚砜100l, 充分振荡后,在酶标仪上测定570mm波长A 570mm值,取3孔的平均值 ,计算细胞毒性指数(CI):CI=(1-实验组A/对照组A) 100%5 流式细胞仪检测细胞周期培养至第8天的细胞更换无血清DMEM培养液,24h后换含不同浓度的TAM (10-9 mol/L), 10-7 mol/L), 10-5mol/L) 5%胎牛血清培养液。 24h后蛋白酶及EDT
4、A消化后离心,收集细胞,PBS洗 3次后离心弃上清,加入PBS1ml,吹匀细胞后,加入95%乙醇2ml固定。流式细胞仪检测细胞周期。6 TUNEL试验培养至第8天的细胞弃去8孔载玻片分别加入不同浓度的TAM (10-9 mol/L, 10-7 mol/L, 10-5mol/L) 5%胎牛血清培养液。孵育 24h后,弃去培养液,4%多聚甲醛固定后,PBS 洗 3次,每次5min 。用TUNEL 法检测细胞凋亡 ,操作严格按试剂盒说明进行,记数高倍视野中500个凋亡细胞的百分比作为凋亡指数(AI)。7统计学处理所有数据均以均数标准差表示,各组间比较检验采用SPSS统计软件处理。结果1 TAM对泌乳素腺瘤细胞增殖的影响MTT 法测定结果表明低、中剂量的三氧苯胺对泌乳素腺瘤细胞增殖无明显影响,高剂量三氧苯胺则对泌乳素腺瘤细胞增殖有明显的抑制作用(表 1)。组别 细胞毒性指数(CI)对照组低剂量组中剂量组高剂量组
