1、1冰片-薄荷脑低共熔物对纳米粒鼻腔给药载药入脑的影响 柴国宝 ，夏爱晓，蔡鑫君，魏颖慧，冯健，李范珠 （浙江中医药大学药学院，杭州，310053）摘要 目的：考察中药冰片-薄荷脑低共熔物对神经毒素纳米粒鼻腔给药吸收入脑的影响。方法：采用 125I 同位素标记法，以清醒自由活动大鼠为实验模型，运用脑微透析取样技术，测定脑内神经毒素浓度的变化，并应用药动学软件计算药动学参数。结果：中药冰片-薄荷脑低共熔物纳米粒脑药动学符合二室模型，Tmax、 Cmax、AUC、t 1/2() 分别为 0.68h、27.32ng/mL、132.68 ngh/mL、3.1076h，其入脑的速度与程度均优于单用薄荷脑或
2、者冰片。 结论：神经毒素纳米粒在冰片-薄荷脑低共熔物作用下，可显著增加其鼻腔吸收入脑的药量，且能较快达到峰浓度，消除缓慢。关键词：冰片-薄荷脑低共熔物;纳米粒;鼻腔给药;脑药动学Effect of borneol/mentholum eutectic mixture on nasal-brain delivery of neurotoxin loaded nanoparticlesCHAI Guo-bao, XIA Ai-xiao, CAI Xin-jun,WEI Ying-hui, Fen Jian,LI Fan-zhu*(College of Pharmacy, Zhejiang Univ
3、ersity of Traditional Chinese Medicine ,Hangzhou,310053)ABSTRACT Objective To investigate the absorption enhancen effect of borneol/mentholum eutectic mixture (BO/ME) on nasal-brain delivery of neurotoxin loaded nanoparticles . Methods Using microdialysis sampling technique in awake freely- moving r
4、ats , the counter per minute (cpm) of dialysates in right PAG of NT-loaded nanoparticles with the BO/ME (BO/ME-NT-NP), radiolabeled with sodium125I-Iodide, were measured in a gamma-counter for radioactivity. After converting cpm into corresponding concentrations of NT byin vivorecovery of microdialy
5、sis probes, the pharmacokinetic parameters were calculated. Results The BO/ME-NT-NP could be absorbed into the brain, much better to NT-NP and the 基金项目 国家自然科学基金项目（30772793） ，浙江省卫生高层次创新人才培养工程 作者简介 柴国宝，男，硕士研究生，研究方向：药物新剂型与新技术，Tel：（0571）86613726 通讯作者 李范珠，教授，博士生导师， Tel：（0571）86633030 Fax：（0571）86613606 E
6、mail： 2nanoparticles with borneol or mentholum only, and the pharmacokinetics accorded with the two-compartment model. The parameters tmax, cmax, AUC, t1/2 () were 0.68h, 27.32ng/mL, 132.68 ngh/mL, 3.1076h. Conclusion With adding BO/ME as absorption enhancer, NT could be significantly increased in t
7、he brain with the help of nanopartilces as carriers, and the time to maximal concentration was short, the elimination process was prolonged.Key Words: bornel/mentholum eutectic mixture; nanoparticles; intranasal administer- ation; brain pharmacokinetic纳米药物载体系统具有靶向、缓释、保护药物等多重作用。前期实验表明1-2：纳米粒作为神经毒素（ N
8、eurotoxin，NT）的载体，既能保持药物的活性，又能增加药物的脑内含量。临床上，NT 主要的给药方式为肌内注射 3，但起效慢（35h） ，难以满足临床要求。鼻腔给药是近年来研究较多的有望成为多肽类药物注射给药替代途径的新型药物传输系统之一 4-5。但鼻腔黏膜吸收能力有限且清除较快，为了提高 NT 的生物利用度，必须加入吸收促进剂。冰片和薄荷脑是近年来研究较多的中药吸收促进剂。冰片具有“芳香走窜，引药上行”之效，能有效改善鼻黏膜与 BBB 的通透性，提高药物脑内浓度 6-7。薄荷脑具有较强的促渗作用，对水杨酸等多种药物具有良好作用 8。将冰片、薄荷脑制成低共熔混合物可以显著增加促渗作用，提
9、高药物疗效，减少药物用量。本课题组前期工作中制备了体外性质良好的神经毒素纳米粒；建立了以微透析技术为平台，测定脑内药物变化的方法。为中药吸收促进剂的筛选与考察奠定了良好的基础。1. 材料1.1 药品与试剂神经毒素：中国科学院昆明动物研究所蛇毒研究中心（纯度99，Mw = 6700） ； 125I-NT （1.38 g/L;1.99108Bq;纯度大于 99%,标记率97%）：复旦大学药学院放射药学教研室协助标记和检测；聚乳酸（PLA）：瑞士Fluka 公司（Mw = 250000；批号：WA18975） ；冰片：Sigma 公司（纯度98.0%；批号：464-43-7）；薄荷脑： Sigma公
10、司（纯度98.5%，批号：89-78-1） 。31.2 仪器SN-695B型智能放免测量仪：上海原子核研究所日环仪器一厂；微透析脑立体定位仪：美国BAS 公司；微透析探针：MD-2200，外径0.5mm，膜长2mm，截留分子量为38kDa；采用自制鼻腔给药装置：专利（专利号：ZL20052001352 5.5）。1.3 实验动物SD大鼠，雄性，体重32020g，由浙江大学医学院动物实验中心提供。2 方法2.1 神经毒素纳米粒的制备采用实验室已优化的制备方法，大致如下：称取50 mg PLA 溶于1.0 mL乙酸乙酯中，加入50L冰片-薄荷脑低共熔物（BO/ME ）（冰片组加等量冰片、薄荷脑组加
11、等量薄荷脑、空白组不加），形成有机相（O ），再将50L 1.0mg/mL的NT水溶液（W 1）加入到有机相中，涡旋乳化30s形成初乳溶液（W 1/O），将 2 mL 0.5%(w/v) 胆酸钠水溶液加入到初乳溶液，冰浴下探头超声乳化36s （90W ）得复乳溶液（W 1/O/ W2），复乳分散到100 mL0.5（w/v）泊洛沙姆（pluronic ，F68）水溶液中，并在真空条件下，旋转蒸发除去有机溶剂，最后40000rpm/min超速离心30min，冻干即得BO/ME-NT- NP。2.2 大鼠脑微透析手术如LI等 9-10所述，大致方法如下：SD 大鼠戊巴比妥钠（ 45mg/kg）腹腔
12、注射麻醉，固定于脑立体定位仪上。按大鼠脑图谱，确定PAG部位（前囟后7mm， 脑表面下5mm，中线旁开0.8mm） ，将脑微透析探针埋植于右侧PAG腹外侧中，固定探针，缝合。术后五天不予实验，将大鼠放置于标准环境（温度222；相对湿度6010；昼夜12h人工交替；自由饮食和饮水）中生活，作为大鼠手术后生理恢复阶段。实验前24小时禁食但可自由饮水，并用饱和碘化钾溶液灌胃（100mg/kg）以饱和甲状腺。实验结束后，猝死大鼠，对大脑进行冷冻切片观察针道，位置不正者，该组数据弃去。2.3 脑微透析探针在体回收率的测定根据文献 11，采用反渗透法测定脑微透析探针在体回收率。取微透析手术完成恢复后的 S
13、D 大鼠，戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔注射麻醉，俯状固定于大4鼠实验板上，取出管心针，将微透析探针插入微透析底座中，在大鼠 PAG 部位用含三种 5ng/mL，25ng/mL，50ng/mL 三种不同浓度的 125I-NT 的灌流液灌流，流量为 2L/min，收集间隔时间为 15min，总时间 1.5h。第一次和最后一次收集的透析液不作参考。每个收集时间点的透析液的 125I-NT 的浓度测一次。在体内反透析过程中，由于 125I-NT 在脑组织中具有较高的扩散能力，所以假设探针周围脑组织间液（brain interstitial fluid，BIF ）中的 NT 浓度为零（C BIF=0
14、） 。体内回收率计算公式：回收率（C dialysate-Cperfusate）/(C BIF-Cperfusate)2.4 纳米粒鼻腔给药脑药动学实验取 SD 雄性大鼠 20 只，随机分成四组进行鼻腔给药：添加冰片/薄荷脑低共熔混合物吸收促进剂的神经毒素纳米粒（NT-NP-）、不添加吸收促进剂的神经毒素纳米粒（NT-NP-）、单独添加冰片吸收促进剂的神经毒素纳米粒（NT-NP-）、单独添加薄荷脑吸收促进剂的神经毒素纳米粒（NT-NP-）（每只大鼠给药相当于 NT 60g/kg，冰片 0.11mg/kg，薄荷脑 0.38mg/kg）。实验时将微透析探针植入微透析底座，探针通过 PE 管与微量泵
15、相连，30min 后，向探针内灌注人工脑脊液，流速 2L/min。平衡 30min 后进行鼻腔给药。于给药后每隔 15min 收集一次透析液，采用自动恒温（4）冷冻收集器连续收集 5 小时，置于收集样品的专用小试管中，并置于 4冰箱中保存，待测放射性强度（cpm） ，并折算成 NT 实际浓度。利用体内回收率校正值得到各时间点 NT 实际浓度，并用药动学软件计算各参数。3 结果3.1 神经毒素纳米粒的制备所得纳米粒大小均一、表面光滑，平均粒径为 106.8nm，Zeta 电位28.40mV，包封率为 70.60%，载药量 8.01。3.2 脑微透析探针在体回收率脑微透析探针插入 PAG 部位，
16、125I-NT 的平均体内回收率（丢失）为12.6%（ S.D.1.2%） 。NT 的体内回收率（丢失）用于透析部位 PAG 的透析液中的实际药物浓度的校正。3.3 纳米粒鼻腔给药脑内药物动力学5不同吸收促进剂 NT 纳米粒经大鼠鼻腔给药后平均脑内药物浓度-时间曲线见图 1，PAG 中 NT 的动力学过程符合二室模型，药动学参数见表 1。051015202530350.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00Time(h)Conc.ofNT(ng/mL)NT-NPs-NT-NPs-NT-NPs-NT-NPs-图 1 四种药物制剂鼻
17、黏膜给药后脑内 PAG 部位药动学比较（ n=5）注：NT-NP-：添加 BO/ME 吸收促进剂的 NT-NP；NT-NP- ：不添加吸收促进剂的 NT-NP；NT-NP-：单独添加 BO 吸收促进剂的 NT-NP；NT-NP-：单独添加 ME 吸收促进剂的 NT-NPFig.1 Pharmacokinetics comparison of PAG position in brain after nasal administration by four pharmaceutical preparation（n=5）Attention：NT-NP-：NT-NP added the absorpt
18、ion enhancer BO/ME；NT-NP-：NT-NP；NT-NP-：NT-NP added the absorption enhancer BO；NT-NP-：NT-NP added the absorption enhancer ME6表 1 药动参数结果(n=5)Table 1 Result of pharmacokinetic parameters(n=5)Parameters NT-NP- NT-NP- NT-NP- NT-NP-Ka（ 1/h） 4.1858 1.0079 2.8953 2.9086 （ 1/h） 0.5391 0.4186 2.9300 2.9079 （
19、1/h） 0.2230 0.2679 0.3742 0.4016t1/2( ) (h) 1.2857 1.6557 0.2366 0.2384t1/2( ) (h) 3.1076 2.5870 1.8522 1.7258t1/2(Ka) (h) 0.1656 0.6878 0.2394 0.2383K21（ 1/h） 0.4819 0.3945 2.9767 2.9074K10（ 1/h） 0.2495 0.2843 0.3684 0.4017K12（ 1/h） 0.0307 0.0077 0.0409 0.0004AUC(0-5h) (ngh/mL)132.68 26.57 66.33 52
20、.05T(max) (h) 0.68 1.74 0.82 0.79C(max) (ng/mL) 27.32 4.53 18.27 15.22由结果可知，添加中药吸收促进剂（低共熔物、冰片或薄荷）的纳米粒可显著增加 NT 入脑的程度与速度，而应用冰片-薄荷脑低共熔物则显著优于单纯应用冰片或者薄荷脑。4 讨论克服血脑屏障，实现脑靶向的方法很多 12-14，如加入吸收促进剂，如冰片、壳聚糖、多聚精氨酸；改变剂型，如载药纳米粒、微球；改变给药方式，如鼻腔给药 15等。 实验室前期工作成果表明，单独使用NT鼻腔给药后，NT几乎不能入脑吸收，而将NT制成纳米制剂，实验结果NT-NPs- 能使药物透过血脑屏
21、障入脑，并具有一定地缓释作用。但是NT吸收量较少，临床用药剂量较大。本课题采用中药吸收促进剂修饰纳米粒进行鼻腔给药，不仅能够促进药物跨血脑屏障，且能增加神经毒素体内的稳定性。实验结果证明，添加冰片-薄荷脑低共熔混和物的神经毒素纳米粒组能显著缩短达峰时间，升高AUC值，延长体循环7时间。其原因可能是BO/ME延长药物在鼻腔中的滞留时间，促进药物的鼻黏膜吸收；也可能是BO/ME打开BBB 紧密结构，促进药物吸收入脑，从而提高脑内药物含量；也可能是上述原因的共同作用。总之，通过中药芳香类物质联合使用纳米药物载体系统能够显著提高蛋白多肽类药物的脑内含量，为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的思路，具有很大
22、的发展前景。但是现阶段中药吸收促进剂与纳米制剂结合研究较少，冰片-薄荷脑低共熔物促进药物入脑的机制，以及如何筛选更好的吸收促进剂都有待进一步研究。REFERENCES1 CHENG Q Y, LI F Z. Brain pharmacokinetics of NT-1-loaded nanoparticles after intranasal administration in rats J. J China Pharm Univ(中国药科大学学报),2007,38(1):77-79.2 CHENG Q Y, LI F Z. Preparation of Neurotoxin- I Nanop
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