1、碱裂解法小量提取质粒DNA,碱裂解法是较常用的质粒DNA提取方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。,实验原理,溶液I: GTE 50mM葡萄糖：增加溶液的粘稠度，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 25mM Tris-Cl（pH 8.0） 10mM EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，并抑制微生物生长。,实验原理,溶液II: NaOH/SDS溶液 0.2 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜
2、）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂。因此，在裂解细菌时要注意： 第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂； 第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。 1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。,实验原理,溶液III：醋酸钾溶液，Ph4.8 当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以
3、复性。 SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA很长，很容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中。,实验原理,酚/氯仿抽提 可以通过酚、氯仿抽提去除残留的蛋白质。酚和氯仿都是蛋白质的变性剂，但酚的变性作用要远大
4、于氯仿。 由于酚能溶解10%-15%的水，因此在使用前要用Tris溶液饱和。以免减少抽提过程中DNA溶液的损失。 水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；氯仿和酚可以互溶，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。 由于酚与水有很大的互溶性，用酚/氯仿抽提后会有少量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。,实验原理,乙醇沉淀DNA 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。 在pH为8左右的溶液中，DNA
5、分子是带负电荷的，乙醇可以消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na离子能与这些带电基团结合，在沉淀形成的部位降低多核苷酸链之间的排斥作用，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。最常用的盐是醋酸铵氯化锂氯化钠醋酸钠。 沉淀体系如果盐浓度高，应在室温下沉淀。放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀。 为了去除随DNA沉淀的盐，可用70%的乙醇洗涤沉淀。,实验原理,DNA的溶解 DNA沉淀经过70%的乙醇洗涤后，在实验台上敞口放置一定时间，使残余乙醇挥发掉。当DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用适当缓冲液溶解便可溶得快速而且完全。完全干燥的DNA沉淀溶解缓慢且效率较低。 得到的质粒样品一般用含RN
6、ase（20 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。,实验步骤,取1.5ml过夜培养菌置于1.5ml离心管中，于微量离心机上以12000rpm离心1min。 弃上清液。 重复步骤1、2 。 短暂离心后，尽量吸干上清液。 沉淀中加100l溶液I，充分悬浮沉淀（用移液体器吹打悬浮或剧烈振荡）。 加入200l溶液 II(新鲜配置)，加盖后缓慢颠倒离心管6次混匀（千万不要振荡），室温防置不超过5 min 。 加入150l预冷溶液III，缓慢颠倒6次混匀，置于冰浴15 min 。,实验步骤,微量离心机上以4，12000rpm离心10min。 将上清液转移到另一新的1.
7、5ml离心管中。 加入等体积酚/氯仿（1：1），震荡1min。 12000rpm,离心5min。 小心转移上层溶液至一新的离心管，弃去中层的蛋白质和下层的有机相。 加入等体积氯仿，震荡1min 。 12000rpm,离心5min。,实验步骤,小心转移上层溶液至一新的离心管，加入 2 倍体积100%乙醇,混匀。 室温放置15min。 12000g10min。 去上清，用0.5ml70%乙醇淋洗沉淀(不要把沉淀悬浮起来)。 12000g30秒。 尽量去上清。 在室温下晾干沉淀。 加入50lTE缓冲液（PH 8.0，含20g/mlRNaseA）溶解质粒DNA 。 80温育20min 。 -20保存。,一、请完成实验报告。报告内容： 1，课件中的全部实验原理及实验步骤 2，实验结果：包括实验现象、结果的记录及描述。 3，实验分析：对实验现象及结果（包括实验经验、心得）的分析、归纳。 二、请预习下周实验：聚合酶链式反应（ PCR）,
