1、1微生物学微生物 (microorganism, microbe) 一词，是对所有形体微小、单细胞或个体结构较为简单的多细胞，甚至无细胞结构的低等生物的总称，或简单地说是对细小的、人们肉眼看不见的、只有借助于显微镜才能看见的生物的总称。但近年来发现有的细菌是肉眼可见的。微生物特点：个体微小、结构简单、繁殖迅速、分布广泛、种类繁多、易变异微生物的分离、纯化及培养技术 分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。 为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保证是一种菌。 常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法 稀释涂布平板法 稀释混合平板法平板划线法 稀释涂布平板法 ： 1
2、、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏 I 号培养基，查氏培养基冷却至 55-60时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒 4 皿，高氏 I 号培养基和查氏培养基各倒 3 皿。2、制备污水稀释液：10g 土样，加入 90ml 无菌水中，在三角瓶中振摇 20min。取 0.5ml 加入盛有 4.5ml 无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。 3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即 10-4、10-5 和 10-6 的试管中吸取 0.1ml 对号放入平板上，用玻棒涂布。 4、培养：高氏 I 号和查氏倒置培养于 28培养箱中培养 3-5days，牛肉膏蛋白胨
3、琼脂培养基在 37培养 1-2days。 5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。 平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。 2、划线方法 稀释混合平板法 ： 1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 23、混合均匀 耗氧、厌氧、兼性微生物的分离方法培养四大微生物培养基种类及条件控制微生物培养技术 1、斜面接种 2、液体培养基接种 3、穿刺接种 4、将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱中培养 5、将生长好的菌种用牛皮纸包好，置 4冰箱中保存。 几种常用的保藏方法： 1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期进行
4、传代培养、再存放。 可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。 3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。 溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。 5、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和 L干燥法。 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。 L-干燥法则
5、不需要低温预冻样品，只是使样品维持在 1020C范围内进行真3空干燥。 消毒：杀死物体上或者环境汇总的病原微生物，并不一定能杀死细菌的孢子或者非病原微生物的方法灭菌：杀死物体上所有微生物的方法。比消毒要求高，包括灭菌细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。防腐：防止或者抑制体外细菌生长繁殖的方法，细菌不一定死亡。抑菌：抑制体内或者体外细菌生长繁殖的方法。常用的抑菌剂为各种抗生素。灭菌方法利用物理因素（温度、辐射、超声波、渗透压、过虑、干燥等）杀灭或控制微生物生长的方法，最重要的因素是温度。热力灭菌法干热灭菌法 ：脱水干燥和大分子变性 焚烧-最彻底的灭菌方法,如废弃物、尸体烧灼-直接用火焰灭
6、菌方法，如接种环、试管口干烤加热 160-170 1-2 小时，如玻璃器皿、金属工具等红外线利用热效应，如医疗器械湿热灭菌法：有水的参与，同一温度下灭菌效果优于干热灭菌水蒸汽的穿透力比干热空气强微生物细胞极易吸收水分子，使蛋白质变性和凝固高温水蒸气接触灭菌物品后凝固成水并放出潜能，使灭菌温度迅速提高，加速微生物死亡煮沸法：水煮 5min(繁殖体 )2 小时( 芽胞)，难以杀死芽胞，消毒食具、刀剪、注射器等巴氏消毒法：低温维持（ 61.1-62.8 30min ）或高温瞬时（71.7 15-30s） ，消毒食品流动蒸汽灭菌法：水蒸汽 1530min(繁殖体)间歇灭菌法：反复多次流通蒸汽间歇加热灭
7、菌高压蒸汽灭菌法：最有效的灭菌方法 103.4kPa(1.05kg/cm2)，121 1520min4影响因素 微生物因素：耐热性芽孢孢子 繁殖体温度与作用时间：致死温度、致死时间pH 值的影响：中性条件微生物的抗热性最强介质的性质：水辐射杀菌法非电离辐射：日光、紫外线、微波等紫外：波长 240300nm 的紫外线具有杀菌作用，其中波长 265nm 紫外线杀菌力最强紫外线使 DNA 相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，干扰 DNA 的复制与转录光复合作用（photoreactivation ） 、光复合酶（photoreactivating enzyme）杀菌能力强，穿透力较弱，用于空气消毒、物品的表面
8、消毒电离辐射：、 和 X 射线等，包括高速电子、 、 和 X 射线，产生游离基，干扰 DNA 合成，破坏细胞膜消毒不耐热的塑料制品，消毒食品不破坏其营养成分微波波长 11000mm 的电磁波，可穿透玻璃、陶瓷和塑料等物质，但不能穿透金属表面微波主要靠其热效应杀菌。主要用于食品、非金属器械、检验室用品，无菌室和病室中食品用具、药杯及其他用品的消毒滤过除菌法用物理阻留的方法除去液体或空气中的细菌，以达到除菌目的适于不耐热也不能以化学方法处理的液体或气体，如血清、毒素、抗生素以及空气等滤菌器（filter）：贝克菲滤器、蔡氏滤器、玻璃或陶瓷滤器、膜滤器过滤效果与滤器孔径大小、滤器与细菌间的电荷吸引、
9、滤速等有关（病毒、支原体、有些 L 型细菌可通过滤器）超声波杀菌法是一种机械的作用因素，每秒超过 2 万赫兹振动的声波即为超声波。5空穴效应：通过超声波在水中产生压力改变（1000 个大气压）造成微生物空腔化，真空状态的空穴造成细胞内外压力差，使细菌细胞裂解而死亡。现主要用于细胞、细菌的粉碎，制备抗原。干燥与低温抑菌法低温灭菌法低温可使细菌的新陈代谢减慢不能灭菌，只能抑制微生物生长用于防腐或保藏菌种干燥灭菌法常用于保存食物冷冻真空干燥法(lyophilization）:在低温状态下真空抽去水分冷冻真空干燥法是目前保存菌种的最好方法，可保存微生物存活数年数十年渗透压灭菌法高渗：细胞脱水、质壁分离
10、低渗：细胞膨胀、破裂主要利用高渗防腐，如盐腌、糖腌法化学消毒灭菌法利用化学因素（消毒剂 disinfectant、防腐剂 antiseptic）杀灭或控制微生物生长的方法同一化学药品低浓度为消毒剂，高浓度为防腐剂一般用于体表、器械、食具和环境消毒影响微生物灭菌因素微生物种类、微生物的物理状态、微生物的数量、消毒剂的性质、浓度和作用方式、时间、温度、酸碱度、有机物、微生物培养基按组成成分分类（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基
11、等。6（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采用。（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。合成培养基 天然培养基主要成分准确测量的化学试剂加蒸馏水 化学成分不明确的天然物质优点化学成分明确，精确定量，可重复性强配制方便，营养丰富，原料易得，培养效果好缺点配制繁琐，成本较高，培养效果一般成分不明确，实验
12、重复性差应用 用于微生物的分类，鉴定，研究 一般用于工业生产按照培养基的物理状态分培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。（1）固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。用于微生物分离，鉴定，计数。用于分离微生物的固体培养基（2）半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。 。（3）液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常
13、用于发酵工业。用于观察微生物生长状态。按照微生物的种类分培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。7（1）常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基。（2）常用的放线菌培养基为高氏 1 号培养基。（3）常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基。（4）常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁蔗糖（或葡萄糖，葡萄糖比较昂贵）琼脂培养基和察氏培养基等。按照培养基用途分培养基按其特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。（1）基础培养基。是含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。
14、（2）加富培养基。是在基础培养基中加入血、血清、动植物组织提取液制成的培养基。用于培养要求比较苛刻的某些微生物。（3）选择培养基。是在普通培养基中加入特殊营养物质或化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。（4）鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。如鉴别大肠杆菌的伊红美蓝培养基，鉴别纤维素分解菌的刚果红培养基。微。微生物保藏方法1、斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于 4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养
15、基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存 6 个月左右，无芽孢的细菌可保存 1 个月左右，酵母菌可保存3 个月左右。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保8藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。2、石蜡油封藏法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端 lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用
16、固体石蜡封口后，垂直放在室温或 4冰箱内保藏。由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达 12 年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。3、砂土管保藏法这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约 110
17、年。4、麸皮保藏法麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在 1 年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。5、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达515 年，存活率
18、高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。9除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。6、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温 80 等，但最常用的是甘油
19、（10%20%） 。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。此法操作简便、高效、保藏期一般可达到 15 年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。四大微生物、细菌：细胞壁主要成分是肽聚糖，由 N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸构成双糖
20、单元，以 -1,4 糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。2、酵母菌：细胞壁厚约 2570nm，细胞壁分为三层，外层为甘露聚糖；中层为蛋白质，其中多数是酶，少数是结构蛋白；内层为葡聚糖，它使细胞保持一定的机械强度。此外，细胞壁还含有少量脂类和几丁质（芽痕） 。3、放线菌：细胞壁主要成分为肽聚糖，并含有 DPA；放线菌菌丝直径与细菌直径基本相同。104、霉菌：细胞壁分为三层：外层无定形的 葡聚糖（87nm)；中层是糖蛋白，蛋白质网中间填充葡聚糖（49nm)；内层
21、是几丁质微纤维，夹杂无定形蛋白质（20nm)。异同点名称 细胞壁 细胞膜 细胞核 拟核 核糖体 细菌 有 有 无 有 有放线菌 有 有 无 有 有真菌 有 有 有 无 有病毒 无 无 无 无 无名称 其他细胞器 生殖方式 代谢类型细菌 芽孢，荚膜，鞭毛。 二分裂 各种放线菌 无 孢子生殖 异养需氧真菌 有 出芽，孢子等 异养，需氧或厌氧病毒 无细胞结构形态细菌菌落一般湿润，较光滑，较粘稠，易挑取，且菌落不是很大；放线菌菌落：菌落较细菌而言更小，干燥，不透明，表面呈致密的丝绒状，上有一层彩色的干粉，菌落与培养基连接紧密，难以挑去；酵母菌：细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润， 粘稠，易
22、被挑起，常见白色、土黄色、红色；霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。显微形态（29）细菌：在显微镜下可区分为球菌、杆菌、和螺旋菌等革兰氏阴性/阳性菌的胞壁11革兰氏染色原理实验原理：革兰染色法是最常用的细菌鉴别染色法。同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。革兰染色的原理，主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰阴性菌细胞壁中含有较多类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞脱色，经复染后，染上复染液(复
23、红) 的颜色；而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，酒精不易进入菌体脱色，故细胞仍保留初染液(结晶紫)的颜色。真核与原核的比较（细胞生物学 P35） 芽孢（微生物教材P55）主/被动运输（细胞教材 105、或者见微生物教材 95 页）被动运输：简单扩散疏水的小分子或者不带电的极性分子水孔蛋白是内在膜蛋白的一个家族，在哺乳动物细胞类至少有 10 种水孔蛋白，在各种特异性组织中，提供了水分子快速跨膜运动的通道。协助扩散各种极性分子和无机离子。如糖、氨基酸、核苷酸、以及代谢产物。需要特异性的膜转运蛋白“协助”主动运输：ATP 驱动泵直
24、接水解 ATP 供能（因此又称初级主动运输） ，实现离子或者小分子逆梯度运动，是一种偶联的化学反应偶联转运蛋白介导各种离子、分子的跨膜运动。分为同向/ 异向转运蛋白，使一种离子或分子逆浓度梯度运动与一种或者多种离子顺浓度梯度运动偶联起来。因两类转运蛋白能同时转运两种不同的溶质，又称为协同转运蛋白。12光驱动泵主要在细菌中发现，对溶质的主动运输与光能的输入相偶联。微生物的生长规律（微生物教材 135）迟缓期：活跃生长，但分裂迟缓，细胞形态变大或者增长，细胞内 RNA，尤其是 rRNA 含量增加，对外界不良反应敏感。在科研、工业中尽量缩短（通过遗传改造、利用对数期做种子、接种前后培养基相差不大、扩
25、大接种量）对数生长期：以最大的速率生长分裂，细菌数量呈对数增加，胞内各成分按比例有规律的增加，所有组分呈彼此相对稳定速度合成。常在工业上作为种子，理想的实验材料。稳定生长期：生长速率降低至 0，对数生长期结束，进入稳定生长，活菌数量最高并维持稳定。可以延长稳定期以获得更多的代谢产物。衰亡期：营养物耗尽，有毒代谢产物积累，细菌死亡数量增加，代谢活性降低出现自溶。同步培养：使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。分批培养：在封闭系统中对微生物进行的培养，既不补充营养物质也不移去营养物质，保持整个培养液体积不变的培养方式。可用来测量生长曲线，观察微生物的生长代谢规律。连续培养：在微
26、生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。在微生物培养过程中采用开放系统，不断地补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。分为恒化器/恒浊器连续培养。可用于发酵产业，产生更好的经济效益。酵母繁殖方式：无性：芽殖（主要繁殖方式）裂殖（少数，如裂殖酵母属） 、产生无性孢子有性：形成子囊孢子环境对微生物的影响（微生物教材 148）营养物质、水、温度、PH、氧； 初/ 次级代谢产物（微生物 129）初级：将微生物从外界吸收的各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。初级代谢过程中的产物为初
27、级代谢产物。微生物生长活动必须，一直产生。13次级：微生物生长到一定时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质，这一过程的产物叫次级代谢产物。大多为分子结构比较复杂的化合物（抗生素、激素、生物碱、毒素、维生素等） ，生长到特定时期产生，对其生命活动非必须。细胞周期：细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的一个有序过程。细胞融合：是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。细胞坏死：是细胞受到化学因素（强酸、强碱、有毒物质） 、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素伤害，引起的细胞死亡现象。细胞凋亡：是机体维持环境稳定、有基
28、因控制的细胞自主的有序性死亡。细胞分化：是指细胞在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。细胞全能性；是指已分化细胞（保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息， ）具有发育成完整个体的潜能。脂筏模型：即在以甘油磷脂为主体的生物膜上，胆固醇、鞘磷脂等形成相对有序的脂相，如同漂浮在脂双层上的“脂筏”一样载着执行某些特定生物学功能的各种膜蛋白。信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的 N-末端的氨基酸序列导肽：又称导向序列(targeting sequence)，它是游离核糖体上合成的蛋白质的 N-端信号。导肽是新生蛋白 N-端一段大约 2080 个氨基酸
29、的肽链, 通常带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸和赖氨酸)含量较为丰富，如果它们被不带电荷的氨基酸取代就不起引导作用，核定位信号：蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核。核孔复合体：核被膜上沟通核质和细胞质的复杂隧道结构，由多种核孔蛋白构成。隧道的内、外口和中央有由核糖核蛋白组成的颗粒。对进出核的物质有控制作用。 活性染色质：是具有转录活性的常染色质14非活性染色质：不进行转录的染色质，包括异染色质和部分常染色质 核仁组织中心：参与形成核仁时的染色质区，核仁组织区定位在核仁染色体次缢痕部位。对人来说，在 13、14 、15、21、22 对染色体
30、上存在核仁组织区。多聚核糖体：是指合成蛋白质时，多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA 分子上，形成的似念珠状结构。在合成多蛋白质时，核糖体并不是单独工作的，常以多聚核糖体的形式存在。一般来说，mRNA 的长度越长，上面可附着的核糖体数量也就越多。线粒体半自主性线粒体 DNA：双链环状、裸露的 DNA 分子1. 线粒体有自己的 DNA 和蛋白质合成系统独立的遗传系统,。2. mtDNA 分子量小、基因数量少、编码的蛋白质有限，只占线粒体蛋白质的10%，而大多数线粒体蛋白质（90%）由核基因编码的，并在细胞质中合成后转运到线粒体中去。3. 线粒体遗传系统与细胞核遗传系统的相互关系调控细胞核线
31、粒体反馈因此，线粒体为半自主性细胞器细胞周期检验点：细胞周期检验点(checkpoint)是细胞周期调控的一种机制，主要是确保周期每一时相事件有序、全部完成并与外界环境因素相联系。在细胞周期中从 G1S，G2 M，M 中期-M 后期存在着三个特殊的时间点(R点),G1S ：G1 S 转换期是决定细胞命运的最主要阶段. G2M：DNA 复制检控点，检测 DNA 复制是否完整以及是否被多次复制M 中期/M 后期 ：保证中期染色体在排列整齐以前，即纺锤体组装完成以前不会启动染色单体分离和 M 期退出机制，以保证染色体分配的准确性受体：一种能够识别和选择性结合某种配体（信号分子）的大分子。（1）细胞内
32、受体: 胞外亲脂性信号分子所激活激素激活的基因调控蛋白（胞内受体超家族）15（2）细胞表面受体: 为胞外亲水性信号分子所激活 （3）受体的结构：识别结构域和催化部位细胞表面受体：离子通道偶联受体;G 蛋白偶联受体；酶偶联受体G 蛋白耦联受体所介导的信号通路一、G 蛋白耦联受体的结构与激活7 次跨膜蛋白，N 末端胞质侧胞外结构域识别信号分子， C 末端胞内结构域与G 蛋白耦联。相关信号途径：cAMP 途径、磷脂酰肌醇途径。(一)以 cAMP 为第二信使的信号通路反应链：激素G-蛋白偶联受体G-蛋白腺苷酸环化酶cAMP cAMP 依赖的蛋白激酶 A基因调控蛋白基因转录 信号分子与 G 蛋白偶联受体
33、结合，使得三聚体 G 蛋白解离，并发生 GTP 与 GDP交换，使 G-GTP 处于活化的开启状态，导致结合并激活腺苷酸环化酶，腺苷酸环化酶催化 ATP 水解为 cAMP，cAMP 与无活性 PKA 从而使 PKA 活化，活化的PKA 又作用于基因调控蛋白从而调控基因转录。（二）以二酰甘油和肌醇三磷酸作为双信使的磷脂酰肌醇双信使通路IP3 和 DAG 双信使效应酶磷脂酶 C(PLC)胞外信号分子G-蛋白偶联受体（结合）G- 蛋白磷脂酶 C(PLC) （1） （2）（1）磷脂酰肌醇IP3胞内 Ca2+浓度升高Ca2+结合蛋白(CaM)激活 PKC细胞反应（2）磷脂酰肌醇DAG激活 PKC细胞反应
34、流动镶嵌模型：认为细胞膜结构是由液态的脂类双分子层中镶嵌可以移动的球形蛋白质而形成的，其强调：膜的流动性，膜蛋白和膜脂均可侧向运动膜蛋白分布的不对称性，有的嵌在膜表面，有的嵌入或横跨脂双分子层细胞骨架（细胞质骨架+核骨架）细胞质骨架：是指存在于真核细胞中、有蛋白质亚基组装而成的纤维网络体系，16主要包括：微丝（肌动蛋白） 、微管（-微管蛋白二聚体组装） 、中间丝。细胞骨架是一类高度动态的结构，他们通过蛋白亚基的组装/去组装过程来调节细胞内骨架网络的分布和结构，通过与细胞骨架结合蛋白、马达蛋白等的相互作用来行使其生物学功能。核骨架：核纤层+核基质，细胞松弛素特异性保护微丝的组装。细胞膜骨架细胞膜
35、下由纤维蛋白组成的网架结构。膜骨架一方面直接与膜蛋白结合，另一方面又能与细胞质骨架相连，主要参与维持细胞质膜的形态，并协助细胞膜完成某些生理功能。细胞冻存、复苏（原则：慢冻快融）当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法1.预先配制冻存液，避免因临时配制产热而伤害细胞： 含 20%血清培养基，10% DMSO 2. 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液
36、, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106 细胞/ml)3 .加入 1ml 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期，放入液氮冻存。4 年后，存活率可达 80100。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入 3738 水浴中，使其融化（ 1 分钟左右）。（2）5 分钟内用培养液稀释至原体积的 10 倍以上。（3）低速离心 10 分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。17细胞凋亡检测（形态学检测（荧光染色法） 、生化（DNA ladder） ）：1 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核 DNA，使之发出明亮的绿色荧光。正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光；凋
37、亡细胞 染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒。但对早期凋亡细胞核活细胞很难区别2 溴乙锭(EB）：仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核 DNA，发橘红色荧光。3 双染：FITC-AnnexinV :AnnexinV 是一种分子量为 3536kD 的 Ca2依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS)有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 AnnexinV 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 AnnexinV 进行绿色荧光素 FITC 标记，以标记了的AnnexinV 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
38、4 DNAladder：细胞凋亡时 DNA 在核小体间断裂 (DNA fragmentation ) 形成一些 DNA 片断,经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生 n 条带，由于这些 DNA 条带经染色并成像之后的整体类似于梯子上的一个个踩踏板， 故称之为 DNA Ladder细胞活力测定（MTT 法）台盼蓝法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 （已淘汰）四唑盐（MTT） （噻唑蓝）比色法：四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色
39、结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。被动运输：（简单扩散、促进扩散（离子通道扩散、易化（帮助）扩散） ）小分子简单扩散：沿浓度梯度（或电化学梯度）扩散；不需要提供能量；没有膜蛋白的协助。脂溶性物质(非极性物质): 苯.乙醇.氧.氮；不带电荷小分子物质: 水.尿素.CO2促进扩散：是指非脂溶性物质或亲水性物质， 如氨基酸、糖和金属离子等借助18细胞膜上的膜蛋白的帮助顺浓度梯度或顺电化学浓度梯度，不消耗 ATP 进入膜内的一种运输方式。主动运输（离子泵、协同运输（共同运输、反向运输） ）小分子：借助于镶嵌在细胞膜上专一性很强的载体蛋白，通过消耗代谢能
40、量，将物质从低浓度处向高浓度处的运输方式。离子泵（ Na+-K+泵）: 泵为 Na+-K+ATP 酶具有载体和酶的双重作用Na+-K+ATP 酶通过磷酸化和去磷酸化过程发生构象的变化，导致与 Na+、K+的亲和力发生变化。在膜内侧 Na+与酶结合，激活 ATP 酶活性，使 ATP 分解，酶被磷酸化，构象发生变化，于是与 Na+结合的部位转向膜外侧；这种磷酸化的酶对 Na+的亲和力低，对 K+的亲和力高，因而在膜外侧释放 Na+、而与 K+结合。K+与磷酸化酶结合后促使酶去磷酸化，酶的构象恢复原状，于是与 K+结合的部位转向膜内侧，K+与酶的亲和力降低，使 K+在膜内被释放，而又与Na+结合。其
41、总的结果是每一循环消耗一个 ATP；转运出三个 Na+，转进两个K+。质子泵: 质子泵有三类：P-type 、V-type 、F-type。1、P-type：载体蛋白利用 ATP 使自身磷酸化（phosphorylation），发生构象的改变来转移质子或其它离子，如植物细胞膜上的 H+泵、动物细胞的 Na+-K+泵、Ca2+离子泵， H+-K+ATP 酶（位于胃表皮细胞，分泌胃酸）。2、V-type：位于小泡（vacuole ）的膜上，由许多亚基构成，水解 ATP 产生能量，但不发生自磷酸化，位于溶酶体膜、动物细胞的内吞体、高尔基体的囊泡膜、植物液泡膜上。3、F-type：是由许多亚基构成的管
42、状结构，H+沿浓度梯度运动，所释放的能量与 ATP 合成耦联起来，所以也叫 ATP 合酶（ATP synthase），F 是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子（factor）的缩写。F 型质子泵位于细菌质膜，线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。F 型质子泵不仅可以利用质子动力势将 ADP 转化成 ATP，也可以利用水解 ATP 释放的能量转移质子。协同运输；载体蛋白介导的物质运输中，许多主动运输不是直接由 ATP 提供能量，而是由储存在膜上离子梯度中的能量来驱动，这一能量来源与进行耦联运19转的蛋白质相联系来完成物质跨膜运输，即一种物质的运输依赖于第二种物质的同时运输 共运输：Na+顺浓度梯度运转的同
43、时伴有葡萄糖或氨基酸的逆浓度梯度运转。对向运输：Na+-Ca+ 和 Na+-H+交换载体 Na+顺浓度梯度进入细胞时供给能量使Ca +逆浓度梯度排出细胞外，这是细胞向外环境驱钙的一种重要机制膜泡（大分子:胞吞、胞吐）：大分子及颗粒物质并不直接穿过细胞膜,而是通过一系列膜囊泡形成和融合来完成的转运过程,属于主动运输。胞吞（胞饮作用、吞噬作用、受体介导的胞吞作用 ）受体介导的胞吞作用：特异性受体与大分子物资结合后，通过膜囊泡系统完成转运如 LDL 颗粒的运转细胞内膜系统（细胞内膜系统是指细胞内在结构、功能及发生上相关 的由膜包绕形成的细胞器或细胞结构）内质网：粗面内质网：蛋白质的合成与转运。滑面内质网：小分子物质的合成与代谢以及细胞的解毒作用（脂类的合成）高尔基复合体：参与蛋白质的分类与包装、运输；多数糖基修饰；糖脂的形成；与高尔基体有关的多糖的合成 20
