1、第 4章 -3 单细胞测序1）什么是单细胞测序？2）为什么要单细胞测序？3）单细胞测序的方法4）单细胞测序的问题5）展望单细胞测序单细胞测序 （ single cell sequencing）， 简称 SCS,系指从单个细胞提取 DNA或 RNA样品进行DNA或 RNA的测序。单细胞测序进展年表Molecular Cell 58, 2015单细胞测序在生物学和医学研究中的应用 -1单细胞测序有广泛的应用领域： 1）神经生物学 根据转录物组来确定神经细胞的类型。 2）生殖遗传 人类单个精子测序发现，每个精子细胞平均发生22.8个重组事件， 5-15个基因转换事件， 25-36个新突变。 3）器官
2、发生 传统的方法是依据少数标记来确定细胞的类型，而单细胞 RNA测序可提供同一类型细胞的转录物组组成。 4）癌症生物学 肿瘤细胞在增殖过程中会发生新的突变，形成遗传异质性亚群体。单细胞 DNA和 RNA测序可揭示异质性肿瘤细胞的基因型组成，为肿瘤的发生，微进化及医疗诊断和治疗提供理论依据。5）医学诊断 血细胞遗传变异检测等。 Molecular Cell 58 , May 21, 2015单细胞测序在生物学和医学研究中的应用 -2单细胞测序有广泛的应用领域： 1）免疫学 体内免疫系统会产生大量的免疫细胞类型。从小鼠 脾脏响应抗原 LPS激活的 40 00个单细胞 RNA测序揭示，存在 7类不同
3、的细胞类群，发生了 1 575个不同的基因应答。 2）微生物学环境中的微生物有 99%是不能实验室培养的，古细菌单细胞 DNA和 RNA测序发现了生命之树中 29个以往未涉及的物种，对生命三域提出了挑战。 3）组织嵌合性 在一类神经细胞中发现 13%41%的细胞存在基因组 CNV（拷贝数变异）。 4）胚胎学 单细胞 RNA测序发现在卵裂球细胞中检测到 1 000个异质性转录产物。 5）产前诊断 可在卵裂球和子宫植入前对胚胎进行单细胞检测，及早发现遗传隐患。 Molecular Cell 58 , May 21, 2015肿瘤细胞遗传异质性单细胞基因组测序-宏基因组学研究宏基因组学的研究必须从环
4、境中收集共生混杂的微生物，然后提取总 DNA。在构建 DNA文库进行高通量测序后，获得的 DNA序列经比对组装。虽然依据 16 rRNA序列可区分环境中微生物的物种组成，但不能区分其它 DNA序列的归属。单细胞测序可以解决上述问题。单细胞提取的 DNA经 MDA扩放后，可构建单细胞基因组测序库，高通量测序后的序列可组装，产生单一基因组序列。单细胞基因组测序-癌变基因组学研究肿瘤细胞产生后，有一个继续发展的过程。由于初始肿瘤细胞增殖后，会在某些个体细胞中发生新的突变并形成新的细胞系。这一过程可能在后续的肿瘤增生时反复出现，形成具有遗传异质型的肿瘤细胞群体。右图显示，在初始肿瘤突变细胞M1增殖后，
5、到取样时肿瘤细胞中已发生了 8次突变。由于细胞增殖和细胞之间的竞争， 肿瘤样品细胞群体中不同克隆系含有的突变基因存在差异。Molecular Cell 58, May 21, 2015单细胞测序 -程序与方法单细胞测序涉及 3个步骤： 1）从细胞群落或组织中分离高质量的有代表性的单细胞； 2）从单细胞中提取和扩放全基因组 DNA或转录产物； 3）进行全基因组范围的 DNA或转录组测序。丰度单细胞的分离表中所列为丰度单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法的实验耗费。 Molecular Cell 58, May 21, 2015罕见单细胞的分离表中所列为罕见单细胞的提取方法及其优缺点和每种方法的实
6、验耗费。 Molecular Cell 58, May 21, 2015常用的单细胞分离技术 图示 5种常用的单细胞分离技术与方法Int. J. Mol. Sci. 16： 16897-16919， 2015常用单细胞分离技术的应用状况Int. J. Mol. Sci. 16： 16897-16919， 2015流式细胞仪激光激活分拣流式细胞仪的发明已有很长的历史。图示制备的携带不同标记的细胞悬浮液样品进入一个 60100 um的管道，在压力液流的作用下，细胞液流形成极微小单个液滴，并依次通过激光检测仪。使用电极板作用微滴，使其产生流向偏转进入收集管 。FACS-Aria III系统每秒可产生
7、100 000个 微滴，分析 70 000事件。激光切割单细胞技术a) 在激光切割分开单细胞后，利用接触使粘帽黏取单细胞。 b)切离单细胞后，利用重力作用驱使细胞转移到试管。 c)利用激光脉冲使切离的单细胞进入收集微管。微流分离单细胞技术悬浮于水溶液中的细胞微流进入油相液体形成微滴，每个微滴含一个细胞（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106： 1419514200， 2009） b)一个薄膜气压阀门可以在气压作用下开关，在开放时单细胞进入微管，使单细胞分离（ Anal. Chem. 79： 85578563， 2007）。c)利用流体动力学，使细胞微流流经适合单细胞的流
8、体动力学陷阱并使其留驻分离（ Lab Chip 6： 2006, 6, 14451449 ）。单细胞基因组测序-DNA扩放单细胞测序的关键步骤是，如何将提取的单细胞极微量的 DNA样品扩放到足以进行 DNA建库的数量。图中是已经报道的 3种单细胞 DNA扩放的方法： a）纯 PCR扩放会丢失许多不处在合成互补引物内的序列； b）等温扩放（ MDA）存在扩放的偏好性，产生非均一扩放； c)杂交扩放具中间覆盖度，一致性较好。Nature Review Genetics 17: 175-188, 2016单细胞WGA-WTA单细胞基因组扩放 (WGA)和转录物组扩放 (WTA)的程序与方法。不同的扩
9、放产生的DNA片段长度相差很大，影响覆盖面。单细胞 DNA扩放 酶 -Phi29在单细胞 DNA测序中，由于起始 DNA量非常少，必须解决单细胞 DNA大量扩增的问题： 1）单细胞 DNA测序对保真度要求非常高； 2）因起始 DNA量非常少，必须大量扩放才可达到实验要求。为了克服上述问题，单细胞 DNA测序采用来自 枯草杆菌噬菌体 Phi29 的DNA聚合酶 (Phi29) ，原因在于 :1) Phi29 具有 高加工性能 ，可产生大于 70 kb的扩放 DNA。2) Phi29 具有很高的 保真度 ，它的 35校读能力可使复制 差错率保持在 1/106107碱基 。3) Phi29遇到下一个
10、引物时， 可将前面已合成的 DNA单链推开继续延伸合成，不必解链，因而可在等温条件下 (30OC)完成反应。4) 由于 Phi29 可将前面已合成的 DNA单链推开，推开的单链又可与引物结合起始新链合成，因而称为 多次取代扩放（ Multiple Displacement Amplification， MDA ） 。Molecular Cell 16： 609618， 2004Phi29 DNA Pol的复制特点Phi29 DNA Pol复制噬菌体基因组有 3个特点： 1）以 DNA末端结合蛋白（ TP）的残基Ser-OH为引物 ；2）与模板链紧密结合， 超长复制 ； 3）可以 自行解开 前面
11、的 双链 ，无需解旋酶。FEMS Microbiol Rev 30： 321381， 2006Phi29DNA聚合酶扩放图解图左： Phi29 DNA聚合酶的活性位置前后通道分别与下游模板和上游双链产物结合，使其不易脱离模板，提高了加工性能；图右：为了便于 MAD扩放， 6碱基随机引物的 3经过硫代磷酸盐修饰，因而可以阻止 Phi29 DNA聚合酶 35外切核酸酶的降解。 Phi29 DNA聚合酶不需解旋酶帮助可将前端双链推开进行取代复制，新合成的单链又可与引物复性，开始又一轮复制。Molecular Cell 16： 609618， 2004单细胞测序 -克服 MDA背景扩放在单细胞测序中，
12、常常会遇到背景扩放（ background amplication）的问题。所谓背景扩放来源于： 1）样品中沾染了外源 DNA； 2）引物与引物的互作。为了降低背景扩放， Zhang K等报道，通过设计 R6(R=A/G)引物 可极大幅度降低背景扩放。 R6引物与 N6（ N=A,T,C, G） 的差别是， R6随机引物中不存在可以互补的引物序列，可以避免引物与引物的互作产生的背景扩放。这一设计可使背景扩放低于 10-4 fg/reaction，低于大肠杆菌单拷贝基因组 10 000X。单细胞测序 -克服 MDA扩放 3偏好在 MDA扩放中，由于 Phi19可以将前面引物 -新链拆开，继续合成
13、。拆开的引物 -新链与引物复性，起始新的合成。这一复制使扩放的产物出现 3偏好。采用 S1核酸酶可将分支单链切断 ，切口处的断口缝合形成完整双链 Nature Biotechnology 24： 680-686， 2006单细胞测序 -扩放序列技术差错单细胞测序技术的应用现代分子生物学研究所面临的最大挑战之一是，如何了解多细胞生物在生长发育过程中不同类型细胞在环境变化时，有哪些基因在正确的时间，合适的场所进行可控水平的表达。生物个体的不同组织器官，同一组织器官处在不同位置的细胞必须协同而又有差别的程序性地开启或关闭某些基因，以便执行正确的生物学功能。在临床医学中，区分病变组织中正常细胞和病态细胞的生理状态，对疾病的诊断和治疗非常重要。单细胞转录物组测序为回答这些重要的基本的生物学问题提供了有效的分析技术与方法。谢谢 !
