1、AKTA 蛋白纯化系统操作AKTA 蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA 系统依据不同的配置，可以分为 AKTA EXPLORER、 AKTA PILOT、AKTA PURIFIER 等多种型号的设备。以下以 AKTA EXPLORER 为例简单介绍 AKTA 蛋白纯化系统的一般操作。1、认识 AKTA。AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1） 。它们是：pH/C 900pH电 导 检 测 器UV-900紫 外 检 测 器190-700nm任 选
2、 三 波 长P-900系 统 泵双 泵 ， 四 泵 头储 物 盒 和 缓 冲 液 托 盘FIG 1、AKTA EXPLORER 主机 Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在 AKTAexplorer 100，流速范围 0.01-100 ml/min，压力高达 10 Mpa（泵名为 P-901） 。在 AKTA explore10，流速范围 0.001-10 ml/min，压力高达 25 Mpa（泵名为 P-903） 。 Monitor UV-900，同时监控 190700 nm 范围内高达 3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。 （针对部分 AKTA PURIFIER 机型
3、，尚有 UPC-900 监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。） Monitor pH/C-900，在线电导和 pH 监测的组合监测器。Fig 2、AKTA EXPLORER 硬件模式图AKTA EXPLORER 系统的主要组成部件可以用模式图表示（ Fig 2） 。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由 UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置 CU950 进行控制。2、一般操作2.1 开机按位于底部平台前
4、左侧的 ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950 上面的 3 个指示灯完全点亮并不闪烁） 。双击桌面上 UNICORN 图标，进入操作界面。UNICORN 的操作界面分为四个窗口（Fig 3）Main Manu 主 菜 单Method Editor 方 法 编 辑System Control 系 统 控 制 Evaluation 结 果 处 理Fig 3、Unicorn 的操作界面2.2准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过 0.45m 的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇） ，需在使用前用低频超声脱气10
5、min。2.3清洗及管道准备首先将 A 泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将 B 泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在 system control 窗口点击工具栏内的 manual，选择 pumppump wash explorer，选中 A1,B1 管道为 ON， execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4)Fig 4、AKTA Explorer 的泵清洗操作2.4 安装层析柱在 manual 里选择 pumpflow rate，输入一定的低流速（Fig 5） ，insert；选择Alarm&monalarm pressure，设置 high alarm（输入填料或层析柱的耐
6、受压力，以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到） ，insert，execute（Fig 6） 。待 InjectionValve 的 1 号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。Fig 5、AKTA Explorer 的流速设定操作Fig 6、AKTA Explorer 的限压设定操作2.5开始纯化：1）在柱子平衡好之后（电导，pH 的数值和变化趋势稳定）即开始上样了。此时应将紫外调零（Fig 7） ，选择 Alarm&monautozero ，exectue 。Fig 7、 AKTA Explorer 的紫外调零操作2）具体上样
7、方式：AKTA 系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击 pause，将 A1 放入样品中，点击 countine，待样品上完后，再将 A1 放入到平衡液中继续清洗柱子。3）洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在 manual 里选择pumpgradient ，按照自己的工艺选择 targetB（100）和 length（10CV ） （Fig 8） 。Fig 8、AKTA Explorer 的洗脱条件设定操作4）设定收集：选择 Fracfractionation_900, 输入每
8、管收集体积，exectue（Fig 9） 。结束固定体积收集选择 Fracfractionation_stop_900，exectue（Fig 10） 。Fig 9、AKTA Explorer 的组分收集设定操作Fig 10、AKTA Explorer 的组分收集停止设定操作5）清洗泵及卸下层析柱：将 A1 和 B1 入口放入纯水中，启动 pump wash purifier 功能冲洗 A 泵和 B 泵及整个管路。然后再将 A1 和 B1 入口放入 20乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最
9、后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。6）关闭电源：从软件控制系统的第一个窗口 unicorn manager 点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭 AKTA 主机电源，关闭电脑电源。3、程序设定操作在 method editor 窗口点击工具栏内的 method wizard，弹出窗口界面如 Fig 11 所示，可以分别在 main selection、column 以及 column position 三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击 next 按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Fig 12） ，在此
10、可以设定检测的波长，针对AKTA EXPLORER 可以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定 A 泵和 B 泵的溶液进口，设定好之后，点击 next，出现如 Fig 13 所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。Fig 11 Fig 12Fig 13 Fig 14完成之后，点击 next 出现 Fig 14 的窗口，在此可以设定上样的条件，可选择的条件包括上样的方式，如上样环上样以及样品泵上样，对上样的体积也要进行设定。如果利用系统泵上样，在此无法进行设置，不过可以利用 A 泵和 B 泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。在上步设置完成之后，点击 NEXT 出现如 Fig 15 所示窗
11、口，这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体内容可能有些差异，这里显示的界面是在安装了 Frac-950 收集器之后所出现的界面，设置完成点击 NEXT 出现如 Fig 16 所示的窗口，设置目标组分收集的一些参数，点击 NEXT，出现如 Fig 17 所示的窗口，针对具体的洗脱条件可以进行设置。当全部设置完成之后，点击 finish，弹出 Fig 18 所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改，完成之后点击 按钮，完成程序存盘操作。至此完成洗脱程序的设定工作，在应用自动洗脱程序时，可在 SYSTEM CONTROL 窗口点击文件菜单栏中的FILERun，
12、在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行，之后会依次弹出一些对话框，主要是再次确认程序的设置条件，并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。Fig 15 Fig 16Fig 17 Fig 184、结果的浏览与简单处理在纯化完成后，Unicorn 软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如果没有指定，那么结果文件会保存于一个文件名以 manual N 开头的文件中，N 为系统依次生成的一个 1-10 之间的数字。对于结果的浏览应在 evaluation 窗口（Fig 19）中进行，打开文件及对文件进行普通编辑的菜单如 Fig 20 所
13、示。Fig 19 Evaluation 窗口Fig 20 纯化结果普通编辑菜单这里已经选择了一个纯化文件，打开后，在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择properties，可以弹出如 Fig 21 所示的操作菜单，可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色，设定横轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。Fig 214、 AKTA 蛋白纯化系统的日常维护4.1 每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用 System Wash Method 完成以蒸馏水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。4.2 每周更换润洗缓冲液（20%乙醇） 。若发现储液瓶液体增多，就说明泵内部有漏液，需要更换泵密封圈。若发现液体减少，需要检查润洗管接头，如果没有漏液，则泵膜或密封圈需要更换。4.3 一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。4.4 在长时间不应用系统进行试验的时候，应将系统管路充满 20%的乙醇，并关闭紫外检测器，清洗 PH 探头，并保存于适当的缓冲液中。
