1、1） 构建克隆2） 转化 BL21 codon plus，先小摇 50mlBD 管子，双抗，0.3mM IPTG，25， 5h（经验值） ，检测蛋白表达情况， 3） 挑单克隆于 100ml 培养基中（250ml 瓶） ，至菌液浑浊 4） 大摇 2.5L，分 5 瓶（2L ） ，每瓶 500ml（上限） ，每瓶加15ml 菌液，单抗，测其 OD 值，至 OD600 在 0.6-1.0 之间，取菌液 1ml(每瓶 200l)，0.3mM IPTG，25 ，5h5） Lysis buffer 配制：用 50 mlBD 管子，加 5mM(1-5mM)咪唑（5M 储液，PH 8.0 4避光）除去非特异性
2、，1mM cocktail，PMSF 要多加（3-4 倍） ，不可加 DTT（对镍柱不利） 、二价离子将菌体取出，融化，按 1L 菌液加 30ml lysis buffer 的比例，将菌体充分悬浮（注意吹打时将吸管插入液面以下，减少气泡的大量产生） ，可分次加入，将菌体转移至 BD 管子中，转移干净菌体悬起后，加入 1%Triton，1mg/ml 的溶菌酶（1:100，可不加），转移至 100ml 小烧杯中，超声处理（一般 200W，15+15 2000s）(注意墙头插入液面以下，避免大量气泡的产生)，此时菌液由粘稠变得一滴一滴6） 将超声后的菌液转入 50ml 大抽离心管中，配平，18000
3、rpm 30min 或 14000rpm 15min 2 次7） Beads 处理（可在超声过程中进行， Beads 不能干）：2L 菌体加 4mlbeads，取 8ml 于 15mlBD 管子中，500g 3min（1000rpm 5min） ，用不含任何东西的 lysis buffer 重悬，Wash2-3 次（ 10 倍 Beads 体积） ，洗去乙醇，之后分成两份用lysis buffer 浸没，置于 4冰库或冰上8） 将上清转入 50ml 管子中，将 Beads 也转入，留少许上清洗Beads，转移干净，4 2h，孵育好后，将管子取出，静止一段时间，让 Beads 沉淀，缩短后面过柱
4、子的时间9） 先将上清转入柱子中，再将 Beads 也转入，4 ，让液体流出，回收存放10） 先用 10mM 咪唑的 Lysis buffer 洗涤（总体积 100ml，前50ml 加 1mMPMSF） （洗涤期间可轻轻吹打 Beads） ，再用20mM 咪唑的 lysis Buffer 洗涤（总体积 100ml，不加 PMSF）（PMSF 影响抗体制备） ，Wash 总体积是 Beads 的 50 倍。期间，取 20mM 咪唑的 lysis buffer（Blank ）和洗涤下来的液体（Sample）测 OD280，使其0.0111） 洗涤完后，将柱子下端口封住，用 300mM（250mM-
5、500mM） 咪唑的 lysis buffer 洗（Elution Buffer） ，沿壁加，EP管接收，每管大约 1ml，用 bradford 测每管浓度。留下蛋白含量最高的管，呈黄绿色，堵上出口，加 Elution Buffer 浸泡 Beads12） PD10 脱盐柱洗脱咪唑：先将保护液倒掉，5ml*5 PBS Wash，将洗脱液按由高到低的浓度梯度，2.5ml 一组加入 PD10柱子中，再加 3.5mlPBS 洗脱，一般前 0.5ml 不含蛋白，用 bio-rad 检测后丢弃，接下来 2.5ml 要收集，后面 0.5ml 咪唑较多归入下一组13） 大约 3-4PD10 管收集后，用 b
6、io-rad 测浓度（BSA 对照）14） 考染再次测浓度，此时样品和 BSA 都做梯度，15） 将样品 500l 分装，做好标记，-80 存放，预定时间，二楼冷冻抽干配制 50mM NaH2PO4,300mM NaCl 储液（A ） ，1M imidazole ph=8.0 储液Lysis buffer:A+1mM imidazole,ph=8.0 ,用前加 1%tritonx-100,1mM PMSF ,cock tailWash buffer:A+10-20mM imidazole ,ph=8.0,用前加 1mM PMSF Elute buffer:A+250-500mM imidazole ,ph=8.0
