1、包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回 :包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化与复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点 :较高的活性蛋白质回收率 ;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离 ;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白 ;折叠复性方法易于放大等。 蛋白复性 的过程通常分为以下几个步骤 :包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤 ,包涵体中主要含有重组蛋白 ,但也有一些杂质 , 如一些外膜蛋白、 质粒 DNA 等 ,这些杂质会与包涵体粘连在一起 ,可以通过洗涤去除大多数杂质 ,但无法将杂蛋白去除干净。包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如 2M 尿素在
2、50mM Tris,pH7、 0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温与去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片与膜蛋白。同时 ,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强 ,所 以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的 NaCl,使包涵体的纯度达到 50%以上。包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍 ,主要就是通过离子间的相互作用 ,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键 ,使多肽延伸。盐酸胍就是较尿素强的变性剂 ,它能溶解尿素不溶的包涵体。 SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、 Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键 ,溶解一些包涵体蛋白质。另外 ,从某些含有半胱氨酸的蛋白
3、质中分离出的包涵体 ,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键 ,这就还需加入还原剂 ,如巯基乙醇、二硫基 苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体 ,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。 二硫键的形 成与断裂就是可逆的 ,直到最有利的蛋白二硫键形成 ,这个平衡才会被破坏。常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱 , 溶解度为用尿素溶解具有不电离 , 呈中性 , 成包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程(8-10M)70-90%本低 , 蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化溶解能力达 95%以上 , 且溶解成本
4、高、在酸性条件下易产生沉淀、盐酸胍复性后除去可能造成大量蛋白质沉作用快而不造成重组蛋白质的(6-8M)淀共价修饰对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构 ,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M 左右时复性过 程开始 ,到 2M 左右时结束 ;盐酸胍可以从 4M 开始 ,到 1、5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性 ,透析复性与柱上复性 ,具体对比如下 :复性简介优点缺点技术慢用折叠缓冲液快速稀释溶解的包涵体蛋蛋白会被稀释到稀释很低浓度白质溶液 , 达到降低变性剂浓度的目的 ,简单复性体积增加较大 , 变
5、使去折叠的蛋白质进行再折叠性剂稀释速度太快 , 不易控制慢透析通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂简单使用大量缓冲液不适合大规模操复性去除速度不增加体积作 , 无法应用到生产规模分子分子筛效应可将蛋白质与小分子变性剂在一步操作中筛层直接进行自动 样品体积受限分离 , 实现溶液交换与蛋白质的折叠析化复性并纯化离子减少导致蛋白质聚集的分子间相互作快速并简单应避免使用与离交换用, 可将蛋白质结合在分离介质上 , 达到 直接进行自动子交换自相反电包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程层析溶液中变性剂浓度的稀释与蛋白质的折化荷的添加叠复性的检测根据具体的蛋白性质与需要 ,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质
6、的复性效率进行检测。1. 凝胶电泳 :一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性与天然状态的蛋白质 ,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。2. 光谱学方法 :可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱 (CD)等 ,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测 ,但一般只用于复性研究中的过程检测。3. 色谱方法 :如 IEX、 RP-HPLC、 CE等 ,由于两种状态的蛋白色谱行为不同。4. 生物学活性及比活测定 :一般用细胞方法或生化方法进行测定 ,较好的反映了复性蛋白的活性 ,值得注意的就是 ,不同的测活方法测得的结果不同 ,而且常常不能完全反映体内活性
7、。5. 黏度与浊度测定 :复性后的蛋白溶解度增加 ,变性状态时由于疏水残基暴露 ,一般水溶性很差 ,大多形成可见的沉淀析出。6.免疫学方法 :如 ELISA、WESTERN等 ,特别就是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。蛋白复性过程的添加剂1.共溶剂 :如 PEG6000-20000,据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团止了蛋白质分子间的相互接触的机会,也可能对复性效率的提高起作用。,此外由于阻一般的使用浓度在 0、 1%左右 ,具体条件可根据实验条件确定。2. 二硫键异构酶 (PDI)与脯氨酸异构酶 (PPI):PDI 可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢
8、复到正常的结构 ,此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量,常常就是复性过程中的限速步骤,而 PPI的作用就是促进两种构象间的转变 ,从而促进复性的进行。3.分子伴侣 ,即热休克蛋白 (HSP),就是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共,研同表达的菌株,据说效果不错。不过在生产中还没有瞧到2 与3 的应用的例子。4. 0、4-0、 6ML-Arg:成功的应用于很多蛋白如 t-PA 的复性中 ,可以抑制二聚体的形成。5. 甘油 :增加黏度 ,减少分子碰撞机会 ,一般使用浓度在 5%-30%。6. 辅助因
9、子 :添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠就是有利的。色谱法 :通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程蛋白分子间的相互影响,该方法得到越来越多的应用,常用的色谱有SEC、 HIC、 IEC、IMAC 等。案例介绍包涵体沉淀的溶解、重折叠与离子交换层析材料与设备Tiss-Tearor?匀浆器透析袋 (Spectra/Por?6)阳离子交换柱SDS-PAGE电泳装置试剂缓冲液 A(1000mL)1mol/L Tris-HCl(PH 7、 9)50mL,50mmol/L0、5mol/L EDTA 1mL,0、5mmol/L5m
10、ol/LNaCl 10ml,50mmol/L甘油 50mL,5%缓冲液 A+50%甘油脱氧胆酸钠 (DOC)N-十二烷基胺酸钠 (SKL)操作程序用 N-十二烷基胺酸钠溶解包涵体沉淀1. 加 18mL 缓冲液 A 与 2mL 20% DOC 储存于包涵体沉淀中。用组织破碎器充分重悬沉淀,室温下静置至少 10min 。2.3.4.悬液于 4 、13000r/min 离心 10min 。弃去上清 (注意留样 ,样品 C),为确保沉淀得到充分洗涤 ,再次按步骤一的操作重悬沉淀。将悬液分成俩个相等的部分,编号 #1 与#2,于4、 13000r/min 离心 10min。对 #1 管中的沉淀 ,加 1
11、9、 7mL 的缓冲液 A 与 0、3mL 的 20%SKL储液。剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。然后静置 30min 。#1 管中溶解的蛋白悬液,置于 4 、 13000r/min 离心 10min 。收集上清液,弃去沉淀。包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程透析除去去污剂使可溶性蛋白重折叠1. 对溶解的物料进行蛋白定量测定 (制作标准曲线时 ,必需用含有 0、3% SKL的牛血清蛋白)。用缓冲液A+0、 3% SKL稀释 ,将溶解的蛋白浓度调至1mg/mL 。2.用缓冲液A 将溶解蛋白制备液稀释10 倍 ,使蛋白终浓度约为0、 1mg/mL,SKL 终浓度约为 0、 03%。3. 4下 ,溶解蛋白制备
12、物 (约 200mL),用 2000mL 缓冲液 A 透析 8h(每 4h,取 150uL 样品 ,用 HPLC测定去垢剂含量 ),同时充分搅拌。然后换新鲜缓冲液并重复。离子交换层析1.2.3.从透析袋中移出经透析的蛋白质溶液,4 、 8000r/min 离心 20min, 除去所有聚集物。留上清 (样品 J),加载于 POROS 50S阳离子交换柱,作为后一级的分级分离。用缓冲液A 洗涤层析用的介质,然后将其倾入带适配器接头的玻璃柱中,装成一总体积为 5mL 的层析柱。用缓冲液A+1mol/L NaCl 洗柱。并用缓冲液A 平衡柱子。4. 如透析就是在低盐环境下进行 ,则可在室温下以 4mL/min 的流速直接将蛋白样品加载于层析柱上。5. 用缓冲液 A 洗柱 15min, 然后在 60min 内 ,以 4mL/min 的流速 ,进行梯度洗脱 (0-1mol/L NaCl/缓冲液 A)。检测 260nm 与 280nm 处的吸收 ,分部收集 4mL 组分。6. SDS-PAGE电泳分析各组分 ,并合并峰组分进行进一步分析。 合并的组分可通过对缓冲液 A+50%透析 ,制备后储存。
