1、1重组蛋白包含体的复性摘要：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。关键词：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active p
2、rotein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, m
3、any renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激
4、酶） 。包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。1. 蛋白质的体内折叠细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin 综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键) 1。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且
5、在翻译结束之前二硫键也能够形成 2。近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI 蛋白） 3、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI） 4等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然
6、环境真核细胞。 蛋白酶、氧化还原电位、PH 和蛋白浓度等性质都不同 5，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没2有真核细胞中相应的协助蛋白折叠的系统。当通过基因工程手段在大肠杆菌中表达外源蛋白时，额外的代谢负担给宿主细胞带来了压力，许多蛋白就会形成包含体。一般来说，处于还原环境的细菌胞质不能有效的完成二硫键蛋白质的氧化折叠 6。也有研究表明，重组蛋白包含体的形成与蛋白质的一些主要的理化参数，如电荷平均数，易形成转角的氨基酸的含量，半胱氨酸及脯氨酸的比例，亲水性以及氨基酸总数等有关 7。2. 蛋白质体外折叠的机理1961 年，Anfinsen 发现，在自由能驱动下，变性后的牛胰核糖核酸酶(RNa
7、se A)可在体外通过空气氧化自发形成正确的二硫键。这个经典的实验揭示了蛋白质一级结构和高级结构的关系，Anfinsen 指出：蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部信息，变性的蛋白质在一定的条件下可以完全自发地恢复活性。他还发现，在一个合适的氧化还原的环境下，蛋白质刚开始错搭的二硫键可以被打开并不断地移位，重排形成正确的二硫键 8。1970 年，Taniuchi 指出，把 124 个氨基酸组成的 RNase A C 末端的 4 个氨基酸去除，剩下的蛋白是无法再折叠形成天然的二硫键的，说明了不完整的 RNase A 结构域是无法正确折叠。接着在 1973 年，Wetlaufer 在进行蛋白质
8、 X-ray 衍射分析时发现，蛋白质在折叠时，不同的结构域是独立进行折叠的 9，1981 年，Lesk 和 Rose10证明了独立折叠的结构域分成亚结构域进行折叠，甚至可以进一步的分割。这些说明了折叠起始于肽链上相邻三四个氨基酸的作用，这些位点能形成二级结构单元（如 螺旋和 折叠）或疏水束，进一步折叠导致较大结构如结构域的形成。Dobson 以溶菌酶为材料深入研究了折叠过程。溶菌酶有 129 个氨基酸，由 和 两个结构域组成。在折叠过程中，先形成 结构域中的2 个 螺旋，再形成另外两个 螺旋，再次是形成 结构域 11。捕捉到折叠过程中的中间态是 70 年代体外蛋白质折叠研究的一个重大突破。实验
9、表明，伸展的肽链(U)折叠成活性蛋白质并不是一步完成的，它经过早期折叠进入中间态(I),然后由中间态过渡到最终具有特定三维结构和生物活性的天然态(N) 12,13。1981 年，Ptitsyn报道了在酸变性时，-lactalbumin 的一种不同于天然蛋白的紧密的结构，后来命名为“熔球态”(molten globule state)。熔球态是蛋白质折叠过程的一种中间态，它具有与N 非常类似的二级结构，但几乎或完全没有三级结构 14。中间体的形成很迅速，从中间体到天然构象折叠则是反应的限速步骤。由于蛋白再折叠过程中会产生一些错误折叠的中间体，同时没有协助折叠的辅助蛋白和酶，同时受到聚集反应的竞争
10、，体外折叠形成蛋白质天然构象所需时间很长，从十几小时到几十小时不等。并不是所有的蛋白都象溶菌酶和牛胰核糖核酸酶一样，在一定的条件下，变性的蛋白质可以自发恢复具有完全活性的天然构象。例如一些胞外蛋白酶（如 水解蛋白酶lytic protease，枯草杆菌素 Subtilisin）等蛋白质的折叠和成熟必须要在前导肽的存在才能完成。这些蛋白酶在体内是以含前导肽（Pro 肽）的前体形式合成的。通过蛋白酶切作用降解 Pro 肽后，蛋白质才成为成熟的有活性的酶。 1992 年，Baker 在 水解蛋白酶的体外复性研究的过程中捕捉到一种熔球态中间体，它在没有变性剂存在下，在生理PH 值条件下可以稳定存在数周
11、时间，一旦加入 Pro 部分，则迅速转变为有天然活性的酶。Pro 肽在蛋白质折叠过程中起到了一个分子内伴侣的作用。现在已知许多蛋白酶的正确折叠必须依赖 Pro 肽的帮助18。具有 Pro 肽辅助折叠机制的有各种蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等 15。3.重组蛋白的复性策略包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、经验性很强的工作。现在，对蛋白折叠的反应机理的了解，使得设计蛋白的复性过程成为可能。然而，每一种蛋白都有自己的特殊性，3仍需不断的实验来摸索出一套最佳的方法。同时在借鉴别人成功的复性方法的基础上，来改进自己的实验。3.1 包含体重组蛋白的变性包含体是相差显
12、微镜下可见的重组蛋白的不溶沉淀，具折光性 16。通常一个大肠杆菌细胞中有一个包含体，所以包含体的质量和数量与发酵水平成正比。包含体一般含有 50以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、膜蛋白 OmpC、OmpF 和 OmpA，质粒 DNA以及磷脂、脂多糖等 17。可以通过洗涤、蔗糖密度超离心等方法使包含体中重组蛋白的纯度提高到 80，方便后续的变复性操作，提高复性率。在包含体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的。它们之间的聚集靠非共价键维持，包括疏水力、范德华力、氢键、静电引力等，唯一的共价键是半胱氨酸之间的二硫键。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包含体，使蛋白变性。
13、变性即破坏非共价键，和用还原剂（如 -巯基乙醇或二硫苏糖醇）打开二硫键 18。常用 56M 的盐酸胍，68M 的尿素。尿素和盐酸胍对蛋白质的变性作用符合 Hofmeister 规则 19。盐酸胍是一种离子型变性剂，它会影响下游的离子交换纯化。但是，盐酸胍比尿素好，除了它本身较强的变性能力外(盐酸胍的变性能力是尿素的 1.52.5 倍)，尿素中的异氰酸盐或酯会引起蛋白质中氨基或巯基的不可逆修饰。实验表明，在 IL-4 的变复性过程中，用盐酸胍来溶解包含体，可以增加蛋白质的复性，但是用尿素时，蛋白质很难恢复活性 20。极端 PH 、高温、去污剂、高浓度的无机盐及有机溶剂都可以溶解某些包含体。如去污
14、剂正十六烷基三甲基氨氯化氨(CTAC)、SDS、Sarkosyl 21也可用作变性剂，但去污剂会与蛋白分子结合并很难除净，限制了它们的应用。另外，极端 PH 溶液主要是破坏蛋白的次级键，只适合极少包含体的溶解，如 Okamoto.H 等在用高碱性 PH 中溶解重组人 glucagon 包含体 22。此外，变性体系中应加入 EDTA、EGTA 等螯合剂来捕获一些金属离子，以防止这些金属离子带来的空气氧化，保持体系的还原性。3.2 变性蛋白的复性方法除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，可以获得天然的活性蛋白。应用的最普遍的再折叠方法有透析、稀释、超滤 21。透析是
15、实验室最常用的办法，但耗时长，容易形成没有活性的蛋白质聚集体。MaedaY设计了一种缓慢透析的办法，用 8mol/L 的尿素溶液作为起始的透析液，然后逐渐增加不含尿素的溶液来降低变性剂的浓度。这种方法中变性剂浓度下降更连续，不会出现稀释法中变性剂浓度突变的情况，可能有助于减少某些蛋白质复性中的沉淀，提高活性蛋白收率。应用这种方法使 IgG 的复性率在 1mg/ml 时达到 70 23.稀释是最简单、也较有效的复性方法。经稀释，变性剂及还原剂下降至一定浓度时，蛋白质分子开始重新折叠，但处理的液量大，不利于工业放大。目前稀释法主要有一次性稀释、分段稀释法和连续稀释法。对于溶解性不太好的蛋白复性可以
16、采用分段稀释法，就是先含高浓度变性剂的蛋白溶液先稀释到一个中间浓度，适量变性剂的存在使沉淀不稳定或较慢形成，从而稳定中间态分子。然后再除去或再降低变性剂，使蛋白分子能形成其天然的有活性的结构。连续稀释法即流加稀释法，可以实现在高蛋白浓度下进行复性，缓慢地连续或不连续将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠.超滤复性是选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。伴随变性剂除去，以相同的速度加入复性液，蛋白浓度保持不变。这种方法较稀释和透析的方法耗时少很多，比较适合生产规模。但是蛋白质在超滤过程中容易在膜上聚集变性，从而限制4了这种办法的应
17、用。有人将超滤和透析方法结合，成功复性牛的 Carbonic anhydrase24。近年来，色谱技术对蛋白质复性的作用得到了广泛的应用。常用的色谱方法有：体积排阻色谱法，离子交换色谱法，亲和色谱法，疏水色谱法。这些色谱法的共同之处是可以通过线性洗脱使变性剂的浓度逐渐降低，复性条件比较温和，层析介质的隔离，降低了蛋白相互作用产生的聚集，可同时实现蛋白的复性和纯化，耗时少。不利之处是很难避免在交换溶液时变性蛋白聚集形成少量沉淀，强烈的吸附在凝胶介质上，造成复性率和柱子载样量降低。Fanhey 等利用凝胶过滤层析 SephacrylS-300 对尿激酶（u-PA）进行复性，复性收率达到 65 25
18、。Han.B 等人将 TGF-2 融合蛋白用盐酸胍溶解后，在 Ni 亲合层析柱上复性，这是实现吸附复性的有效办法 26。3.3 复性时促进二硫键形成的方法许多真核蛋白都含有二硫键。对于一个原有二硫键的变性蛋白来说，一个关键的反应就是天然二硫键的再生。这就需要在复性前用 DTT 或 -ME 打开二硫键，使其变成SH 的形式，在复性时，提供合适的氧化还原电位，使两个SH 形成正确的二硫键。二硫键正确配对才能维持蛋白的天然结构，保持其活性。较常用的方法有三种：（1）空气氧化法。在碱性条件下，暴露于空气中或往复性液中通气，某些金属离子（如 CuSO4）或微量的硫醇类化合物存在时，此法效果更好。这是一个
19、廉价的方法，但时间较长，且不易控制反应过程。 （2）谷胱甘肽氧化法：在复性液中加入低分子量的还原和氧化的含巯基的化合物，提供合适的氧化还原电位，可以帮助复性中二硫键的正确形成。常用 10：1 或 5：1 的还原型/氧化型的谷胱甘肽和 13mmol/L 的还原型巯基试剂。也有人在复性 IL-4 时使用半胱氨酸体系。但是最适的氧化型试剂和还原型试剂的比例，须经实验摸索才能得到。在进行尿激酶原的复性研究时发现，GSH/GSSG 比为10：1,Cysteine/Cysine 比为 600：1 时，最有利于 pro-UK 的复性 27。二硫键不正确的分子通过这种巯基交换体系重新形成正确的二硫键，提高复性
20、/氧化的速度和产量。对于含有多个 Cys 的重组蛋白，通常在变性条件下，先将蛋白内所有游离的巯基在过量的氧化型谷胱甘肽（0.10.2mol/L）下全部氧化成与谷胱甘肽的二硫键，然后除去变性剂和过量的谷胱甘肽，同时在反应中加入半胱氨酸促使分子内二硫键的形成 28。 （3）混合二硫化物氧化法。在变性条件下，加入亚硫酸钠和连四硫酸钠（Na 2S4O6）可使二硫键还原，并将游离的半胱氨酸变为 S磺酸化的形式，连四硫酸钠是一个温和的氧化剂，在复性过程中加入巯基试剂就可以除去磺酸基团 29。 3.4 影响复性的因素3.4.1 蛋白浓度复性过程中的聚集反应是导致复性率低的首要原因。当变性剂浓度降低后，变性的
21、蛋白分子迅速折叠形成具有大量二级结构的中间态分子，折叠中间态分子表面的暴露的疏水区域相互作用，发生聚集作用。蛋白聚集和正确的折叠是两个竞争反应。由于正确的折叠是一级反应，而聚集是两个或以上肽链分子的反应，受蛋白浓度影响大。为减少聚集并促进折叠反应，通常将蛋白质稀释到很低的浓度（1100ug/ml） ，但同时也限制了它的大规模应用，所以，许多蛋白质复性方面的研究集中在如何在复性的蛋白浓度尽可能高些的情况下减少沉淀同时获得高收率。3.4.2 温度和 PHPH 是影响复性的产率和速率的重要因素，尤其是对含有二硫键的蛋白来说。在不影响正确折叠的前提下，高 PH 可以防止自由硫醇的质子化对正确配对的二硫
22、键形成的影响。常5用 Tris 缓冲液维持 PH 为 89。通常来说，当环境的 PH 值接近蛋白的等电点时，聚集就会增多 30。而再折叠温度多在 040，常用 2025的室温22。在这个范围内，提高温度通常会加快折叠及提高收率，但超过 40，折叠的效率反而下降。在对尿激酶原（ProUK）的复性研究中,发现温度对 Pro -UK 复性有很大影响 ,在 4到 37范围内,温度越高, Pro -UK 复性效率越低,它的复性操作均在 4进行，回收率可达到 2030 27。低温下，折叠速度减慢有利于蛋白形成天然构象。每一种蛋白都有自己最适合复性的温度和PH，应该通过实验确定。3.4.3 稀释倍数稀释倍数
23、是复性的重要因素。稀释时蛋白浓度和变性剂浓度都在下降。复性时，蛋白浓度通常很低（3mol/L）,可使蛋白质失活变为具有一定二级结构的松散肽链。但是，在较低的浓度下是一种很好的促溶剂，能够有效的防止变性蛋白质分子间疏水相互作用，防止不可逆聚集体的出现。Hevehan 在溶菌酶的复性液中加入 1.25mol/L 的盐酸胍使 1mg/mL 的溶菌酶几乎全部复性，在 5mg/ml 时达到 80的复性率 32。L-Arg 可以提高重组组织纤溶酶原激活剂（tPA） 、单链免疫毒素、Fab 抗体、人 干扰素和溶菌酶的复性收率。0.5M L-Arg 使溶菌酶复性率提高到 80 32， 干扰素复性率提高 10
24、倍32。分析表明 L-Arg 可特异性结合于错配的二硫键和不正确折叠结构，使折叠错误的分子不稳定从而推动分子形成正确结构。因为 L-Arg 结合错折叠分子不具有蛋白质种类特异性，所以这种方法有一定通用性。 PEG 也被用于提高复性产率。它的脂肪链的结构能结合到折叠中间体上的非极性区域，从而阻止其聚集沉淀。在复性液中加入终浓度 3g/L 的 PEG，可使 0.5mg/ML 的 Carbonic anhydrase B 复性速度提高 3 倍 34。单克隆抗体可以帮助核糖核酸酶 A 的 S 蛋白片段复性。蛋白质的特异抗体在复性中成为了分子模板。将 S 蛋白还原并与 S 蛋白的单克隆抗体混合，加入谷胱
25、甘肽提供合适的氧还电位，24 小时后停止复性，用分子筛分离 S 蛋白。不用单克隆抗体，酶的活力只恢复了13；使用抗体，活性提高到 54。但这种方法需要单克隆抗体，费用昂贵，不适合工业化生产 35。与其生理条件下的作用相似， 分子伴侣在体外也能促进变性蛋白的重折叠。如在抗体的再折叠中发现，BIP 和 PDI 都能促进复性 36，但是，纯化的分子伴侣成本很高。Fresht将小分子伴侣（GroEL）固定于凝胶介质上，对蝎子毒素 Cn5 进行了成功的复性 37。硫氧化蛋白（TrxA、TrxC）也是分子伴侣的一种，是大肠杆菌的胞质蛋白，因催化还原和交换二硫键，氧化自由的巯基，被用于含二硫键的蛋白分子的复
26、性。TrxA 的共同过表达可以提高蛋白的溶解表达。Sachdev 用大肠杆菌的 Maltosebinding protein(MBP)和 TrxA分别和哺乳动物的 Procathepsin D 和 Pepsinogen 形成融合蛋白，在大肠杆菌中仍形成包含体，但是复性后可溶的融合蛋白量大大提高 38。同样机理，复性液中加入 100mM 硫氧还6蛋白，胰腺的 RnaseA 基本恢复活性 39。硫氧还蛋白不仅促进去折叠的蛋白分子复性，也可以促进部分折叠或是二硫键部分错误的分子形成正确构象。但是分子伴侣的经验性很强，因为分子伴侣对底物蛋白具有一定的特异性，适合这种蛋白复性的分子伴侣未必适合另一种蛋白
27、。-环糊精被称为人工分子伴侣，它可以帮助抗纤维蛋白单链抗体尿激酶融合蛋白复性 40。蛋白质首先溶解在高浓度的变性液中（离子型变性剂） ，通过稀释降低变性剂浓度至没有聚集产生，然后用 -环糊精抽取剩余的变性剂完成复性。-环糊精是个螺旋的中空去顶的圆锥形分子，中间有内腔，与分子伴侣 GroEL 分子很像，这可能是它能帮助复性的原因。在未来相当长的时间内，包含体路线仍是获得重组蛋白的主要途径。因而如何在高蛋白浓度条件下提高复性的收率及活性是工艺探索的关键,同时，建立灵敏有效的生物学和免疫学测活方法，以区分正确折叠和错误折叠的蛋白，从而比较复性效率，在整个实验过程中就非常重要。参考文献：1. Bald
28、win RL. How does protein folding get started? TIBS, 1989, 14:2912. Gilbert HF. The formation of native disulphide bonds, in Mechanisms of protein Folding (Pain,R,H.,ed.)pp.104136.IRL/Oxford University Press, Oxford, UK,19943. Bulleid NJ, freedman R B. Defective co-translational formation of disulphi
29、de bonds in protein disulphide isomerase-deficient microsomes. Nature, 1990,335:6496574. Hartl FU, et al, Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations. TIBS, 1994,19(1): 20.5. Thatcher DR. and Hitchcock A. Protein folding in biotechnology, in Mechanisms of Protein F
30、olding (Pain, R. H., ed.), pp. 229-261. IRL/Oxford University Press, Oxford, UK, 1994.6. Paul H. Besssette, et al, Efficient folding of protein with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. PNAS, 1999, 96, 24:1370313708.7. Hanning G, et al, Strategies for optimizing heterologous p
31、rotein expression in Escherchia coli. Trends Biotrchnol,1998,16(2):54-608. Anfinsen CB. Principles that govern the folding of protein chains. Science, 1973, 181(4096): 223230.9. Wetlaufer DB, Nucleation, rapid folding, and globular intrachain regions in proteins. PNAS.USA 1973,70:697701.10. Lesk AM,
32、 et al, PNAS,1981,78:4304-430811. Dobson CM., et al, Understanding how proteins fold: The lysozyme story so far. TIBS, 1994, 19, 31.12. Creighton TE. Intermediates in the refolding of reduced pancreatic trypsi inhibitor. J. Mol. Biol, 1974, 87: 579602.13. Cook K H., Schmid FX., Baldwin RL. Role of p
33、raline isomerization in folding or ribonuclease A at low temperatures. PNAS, 1979, 76: 61576161.14. Dolgikh DA, et al. Alpha-lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure. FEBS Lett. 1981 Dec 28,136(2): 311315.15. Chen LiMing, et al，Intramolecular chaperonethe role of Pro peptide in
34、 protein folding, Chinese Bulletin of Life Sciences, 2002，14，1：3539.16. Kane JF, Hartiey DL. Formation of recombinant protein inclusion bodies in Eschericha coli. 7Tibtech, 1988, 6:95.17. Schein CH. Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Bio. Technol,1989,7: 1141.18. Kohno T, Carmic
35、hael DF, Sommer A，et al. Refolding of recombinant proteins. Methods Enzymol, 1990,185: 187195.19. Li Wei，Ou Yang Fan . Hofmeister Effect and Inclusion Bodys Denaturation and Renaturation. Biotechnology Information. 2000,4: 3740.20. Kimmenade A, Bond MW, Schmacher JH, et al. Expression, renaturation
36、and purification of recombinant human Interleukin 4 from E. coli Eur. J biochem, 1988, 173: 109114.21. de Bernardez CE, et al. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9,2: 157163.22. Okamoto H et al. An improved method for large-scale purification of reombinant human glucagons
37、. J Protein Chem, 1995, Oct,14,7:521526.23. Maeda Y, Ueda T, Imoto T, Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G In vitro without assistance of chaperone. Protein Eng, 1996,9: 95100.24. West SM, et al. Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis. Biotechnol
38、Bioeng, 1998 Mar 5,57(5):590599.25. Fahey. EM, Chaudhuri J B., et al. Refolding and purification of urokinase plaminogen activator fragment by chromatography. Journal of Chromatography B,2000, 737: 225235.26. Han B et al. Refolding of a recombinant collagon-targeted TGF-beta2 fusion protein expresse
39、d in Escherichia coli. Protein Expr Purif,1997 Nov,11(2):16978.27. Zhu Hui, et al, In vitro renaturation of recombinant human pro-urokinase expressed in Wscherichia coli. Chinese Medical Journal, 2002,114(2):186-190.28. Mukhopadhyay A. Inclusion bodies and purification of proteins in biologically ac
40、tive forms. Adv.Biochem. Eng. Biotechnol, 1997,56: 61109. 29. Chaudhuri JB. Refolding recombinant proteins. Ann NY Acad Sci, 1994,721: 374385.30. Ming Li, et al, Dual gradient ion-exchange chromatographt improved refolding yield of lysozyme.Journal of Chromatography A,959(2002):113-12031. Cleland JL
41、, et al, Transient association of the first intermediate during the refold of bovine carbonic anhydrase B. Biotechnol Prog.1992,8:9732. Hevehan D, et al. Oxidative renaturation of lysozyme at high concentrations. Biotechnol Bioeng, 1997, 54:221.33. Han B et al. Refolding of a recombinant collagon-ta
42、rgeted TGF-beta2 fusion protein expressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif, 1997 Nov,11(2):169-7834. Cleland JL, et al. Cosolvent assisted protein refolding. Biotechnology(NY),1990 Dec,8(12):12741278.35. Carlson JD, et al. Antibody assisted protein refolding. Biotechnology(NY), 1992,Jan,10(1)
43、:8691.36. Mayer M, et al, BIP and PDI cooperate in the oxidative folding of antibodies in vitro. J Biol, 2000, 275;29421-29425.37. Chaudhuri JB. Refolding recombinant proteins. Ann NY Acad Sci, 1994,721: 374-38538. Altamirano MM, et al. Oxidative refolding chromatography:folding of the scorpion toxi
44、n Cn5. Nature Biotechnol, 1999,Feb,17:188191.39. Sachdv D, et al. Solubility of protein isolated from inclusion bodies is enhanced by fusion 8to maltose-binding protein or thioredoxin. Protein Expr Purif,1998,12:122132.40. Pigiet VP,et al. Thioredoxin-catalyzed refolding of disulfide-containing proteins.Proc Natl Acad Sci USA.1986 Oct,83(20):76437647.
