1、质粒提取简介及问题分析一、导论(一) 质粒提取的原理：为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I，50 mM 葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液 II，0.2 N NaOH，1% SDS；溶液 III，3 M 醋酸钾，2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液 I 的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-HCl 溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒
2、的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA。如果手上正好缺了溶液 I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或 LB 培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有
3、结块。 轮到溶液 II 了。这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2%的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N 的 NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜 )结构向 micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下 )，自然
4、就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白
5、沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加 2M 醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现显然与 SDS 的加入有关系。如果在溶液 II 中不加 SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1%的 SDS 溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl，会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(SDS)遇
6、到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(PDS)，而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。(二)细菌的收获和裂解。细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的
7、裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于 3 个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒 DNA 的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1、大质粒(大于 15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和 EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入 SDS 一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2、可
8、用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入 EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒 DNA 链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3、一些大肠杆菌菌株(如 HB101 的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒 DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒 DNA 内污染有糖类，而糖
9、类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如 HB101 和 TG1 等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4、当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌菌株 (endA 株，如 HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在温育( 如用限制酶消化 )时，质粒 DNA 会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提 )可以避免此问题。5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒 DNA 的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌
10、裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒 DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒 DNA 的量大致相等。(三)质粒 DNA 的纯化。常用的纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体 DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环 DNA 分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与 DNA 结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状 DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒 DNA 中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止
11、了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和(每 2 个碱基对大约结合 1 个溴化乙锭分子)。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环 DNA 分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒 DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒 DNA 和宿主 DNA 的方法。二、质粒 DNA 的小量制备(一)细菌的收获和裂解。1、收获。1) 将 2ml 含相应抗生素的 LB 加入到容量为 15ml 并通气良好 (不盖紧
12、)的试管中，然后接入一单菌落，于 30剧烈振摇下培养过夜。2) 将 1.5ml 培养物倒入离心管中，4 、12000g 离心 30 秒，将剩余的培养物贮存于 4。3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。2、碱法裂解。1) 将细菌沉淀，所得重悬于 100l 用冰预冷的溶液 I 中，剧烈振荡。溶液 I 可成批配制，高压下蒸气灭菌 15 分钟，贮存于 4。须确使细菌沉淀在溶液 I 中完全分散。2) 加 200l 新配制的溶液。盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3) 加 150l 用冰预冷的溶液。盖紧管口，将管倒置后温和
13、地振荡 10 秒钟溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3-5 分钟。4) 用离心机于 4、12000g 离心 5 分种，将上清转移到另一离心管中。5) 可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀， 用微量离心机于 4 以 12000g 离心 2 分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的 DNA。6) 用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀双锭 DNA。振荡混合， 于室温放置 2 分钟。7) 用微量离心机于 4以 12 000g 离心 5 分钟。8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所
14、有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。9) 用 1ml70%乙醇于 4洗涤双链 DNA 沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥 10 分钟。i. 此法制备的高拷贝数质粒(如 Xf3 或 pUC)，其产量一般约为：每毫升原细菌培养物 3-5g。ii. 如果要通过限制酶切割反应来分析 DNA，可取 1l DNA 溶液加到另一含 8l 水的微量离心管内，加1l 10限制酶缓冲液和 1 单位所需限制酶， 在适宜温育 1-2 小时。将剩余的 DNA 贮存于-20。iii. 此方法按适当比例放大可适用于 100ml 细菌培养物：。3、煮沸裂解。1) 将细菌沉淀，所得重悬于 350lSTET 中。STET ：
15、0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100 。2) 加 25l 新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振荡 3 秒钟以混匀之。如果溶淮中 pH 低于 8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3) 将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为 40 秒。4) 用微量离心机于室温以 12000g 离心 10 分种。5) 用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。6) 在上清中加入 40l 5mol/L 乙酸钠(pH5.2) 和 420l 异丙醇，振荡混匀，于室温放
16、置 5 分钟。7) 用微量离心机于 4以 12 000g 离心 5 分种，回收核酸沉淀。8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9) 加 1ml 70%乙醇，于 4以 12 000g 离心 2 分钟。10)按步骤 8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)
17、分钟。 11)用 50l 含无 DNA 酶的胰 RNA 酶(20g/ml) 的 TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20。 注：当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌株 (endA 株，如 HB101 )中小量制粒尤其 DNA 时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶 A，以后在 Mg 2 存在下温育(V 中用限制酶时)质粒 DNA 可被降解。 在上述方案的步骤 9)之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。(二) 质粒 DNA 小量制备的问题与对策。碱裂解和煮沸都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有什么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰
18、到过两个问题：1、有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化 DNA。2、在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒 DNA 的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。三、质粒 DNA 的大量制备(一) 在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl 或 ColEl 复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下
19、步骤可提高产量至每 500ml 培养物2-5mg 质粒 DNA，而且重复性也很好。1) 将 30ml 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600 约 0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。2) 将含相应抗生素的 500ml LB 或 Terrific 肉汤培养基(预加温至 37)施放入 25ml 对数晚期的培养物，于 37剧烈振摇培养 25 小时( 摇床转速 300 转/ 分) ，所得培养物的 OD 600 值约为 0.4。3) 可做可不做：加 2.5ml 氯霉素溶液 (34mg/ml 溶于乙醇)，使终浓度为 170g/ml。像
20、pBR322 一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC 质粒)可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。4)于 37剧烈振摇 (300 转/分)，继续培养 12-16 小时。(二) 细菌的收获和裂解。1、收获。1) 4以 4000 转 /分离心 15 分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清
21、全部流尽。2) 将细菌沉淀重悬于 100ml 用冰预冷的 STE 中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。3) 按步骤 1)所述方法离心，以收集细菌细胞。2、碱裂解法。1) 将冼过的 500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤 3 重悬于 10ml(18ml)溶液 I 中。2) 加 1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶于 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。当溶液的 pH 值低于 8.0时，溶菌酶不能有效工作。3) 加 20ml(40ml)新配制的溶液。盖紧瓶盖，缓缓
22、颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10 分钟。4) 加 15nl(20ml)用冰预冷的溶液。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放 10 分钟，应形成一白色絮状沉淀。于 0放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量 RNA 和钾 -SDS-蛋白质- 膜复合物。5) 用合适转头于 4以 4000 转/ 分离心 15 分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以 5000 转/分再度离心 20 分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液与细菌裂解物混合不充分步
23、骤 4)。6) 上清过滤至一 250ml 离心瓶中，加 0.6 体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置 10 分钟。7) 用合适转头于室温以 500 转/分离心 15 分钟，回收核酸。如于 4离心，盐也会了生沉淀。8) 小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用 70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。9) 用 3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。四、质粒 DNA 的纯化(一) 聚乙二醇沉淀法提取质粒 DNA。1、将核酸溶液所得转入 15mlCorex 管中， 再加 3ml 用冰预冷
24、的 5mol/L LiCl 溶液，充分混匀，用合适转头于 4下以 10000 转/分离心 10 分钟。LiCl 可沉淀高分子 RNA。2、将上清转移到另一 30mlCorex 管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用 SorvallSS34 转头(或与其相当的转尖)于室温以 10 000 转 /分离心 10 分钏， 回收沉淀的核酸。3、小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用 70%乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4、用 500l 含无 DNA 酶的胰
25、 RNA 酶(20g/ml )的 TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置 30 分钟。5、加 500l 含 13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的 1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于 4以12000g 离心 5 分钟，以回收质粒 DNA。6、吸出上清，用 400l TE(pH8.0)溶解质粒 DNA 沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽 1 次。7、将水相转到另一微量离心管中，加 100l 10mol/L 乙醇铵，充分混匀，加 2 倍体积(约 1ml)乙醇，于室温放置 10 分钟，于 4以 12 000g 离心 5 分钟，以回收沉淀的质粒 DNA。
26、8、吸去上清，加 200l 处于 4以 12 000g 离心 2 分钟。9、吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10)用 500l TE(pH8.0)溶解沉淀 1：100 稀释 用 TE(pH8.0) 后测量 OD 260，计算质粒 DNA 的浓度(1OD260=50g质粒 DNA/ml)， 然后将 DNA 贮于-20 。10、纯化。一些试剂的生化作用原理1、溶液溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1,4 糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA：金属离子螯合剂，螯合 Mg2+，Ca2+等金
27、属离子，抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)对 DNA 的降解作用(DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基)，同时 EDTA 的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。2、溶液-NaOH-SDS 液NaOH：核酸在 pH 值为 59 的溶液中是最稳定的，但 pH 大于 12 或小于 3 时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液中的 NaOH 浓度为 0.2N，加入提取液时，该系统的 pH 就会高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白 S
28、DS 蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但 SDS 能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，以防用 RNase 去除 RNA 时受到干扰。3、溶液-3M KAc(pH4.8)溶液：KAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶液实际上是 KAc-HAc的缓冲液。用 pH4.8 的 KAc 溶液是为了把 pH 12.6 的抽取液 pH 调回到中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3molL KAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷
29、。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。4、为什么用无水乙醇沉淀 DNA:此为实验中最常用的沉淀方法。乙醇的优点是低度极性，可以以任意比例和水相混容，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液时以水合状态稳定存在的 DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合。其乙醇的最终含量占 67%左右。因而也可改用 95%乙醇来代替无水乙醇 (因无水乙醇价格更贵 )，但加 95%乙醇使总体积增大，而
30、DNA 在溶液中总有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会影响收得率。折衷的做法是初次沉淀 DNA 是可用 95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用异丙醇选择性沉淀 DNA，一般在室温下放置 1530min 即可。使用乙醇在低温条件下沉淀 DNA，分子运动大大减少，DNA 易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA 沉淀得越快。5、RNase 处理核糖核酸后，再次沉淀 DNA 时为什么一定要加 NaAc 至最浓度达 0.10.25M。在 pH 8 左右的 DNA 溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc，使 Na+中和 DNA 分子上的
31、负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 纳盐沉淀。当加入大量盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不太好，在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6、为什么将 DNA 保存于 TE 缓冲液中？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa2=7.2) 、硼酸系统 (pKal=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可以作为DNA 的保存液
32、，但在转化实验时，磷酸根将与 Ca2+产生沉淀；在 DNA 酶反应时，不同的煤对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有哦则要求低盐离子浓度，采用 Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲对时 Tris+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA 时，大都采用 Tris-HCL 系统，而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳定 DNA 的活性。操作要领：1、该实验成功的标志是把染色体 DNA，蛋白质与 RNA 去除干净。获得一定收得率的质粒 DNA。去掉染色体 DNA 最为重要，也较困难。因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体 DNA，其关键步骤
33、是加入溶液与溶液时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体 DNA 充分作用使之变性；又要使染色体 DNA 不断裂成小片段而能与质粒 DNA 相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。摇动时用力适当。一般加入 SDS 后要注意不能过分用力振荡，但又必须让它反应充分。2、当加入溶液5min 后，若没有看到溶液变稠时，实验不能再继续做下去了。3、配置试剂时，要用重蒸水配置外，其器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗三次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对 DNA 的降解，对 Ep 管、Tip 头与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在 50温箱中烘干使用。4、用乙醇沉淀 DNA 时，要观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可放在冰箱中去沉淀 DNA。
