1、实 验 二,微生物培养基的配制和灭菌,微生物培养基的配制和灭菌,目的要求 实验材料 实验程序,目 的 要 求,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。 其它：天平、牛角匙、电炉、2MHCl、2MNaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、
2、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。,实 验 程 序,培养基的配制 分离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌方法,实验程序1:培养基的配制,培养基 培养基的配制原则 培养基的种类 培养基的配制方法和步骤 培养基的配方及配制 无菌水的制备,培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等的基础 。,培养基的配制原则,一、营养成分 二、PH值 三、渗透压 四、氧化还原电位,一、营养成分总体原则1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基， 如自养型微生物：由简单的无机物质组成
3、异养做生物：至少需要含有一种有机物质。按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号合成培养基，麦芽汁培养基，查氏合成培养基。,培养基的配制原则,能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。微生物的能源谱：,培养基的配制原则,有机物：化能异养微生物（同碳源）,无机物：化能自养微生物（不同于碳源）,化学物质,辐射能：光能自养和光能异养微生物,能源谱：,化能自养微生物的能源物质都是一些还原态的无机物质，例如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+ 等，能利用这些物质作为能源的全部是细菌，如：硝酸
4、细菌、亚硝酸菌、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。这些无机养料常常是双功能的（如： NH4+ 既是硝酸细菌的能源，又是它的氮源。）有机营养物常有双功能或三功能作用，既是异养微生物的能源，又是它们的碳源或氮源。辐射能是单功能的，只为光能微生物提供能源。,培养基的配制原则,2.注意各种营养物质的浓度与配比营养物的浓度：营养物质浓度太大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。各营养物质之间的浓度比：尤其是碳氮比（CN）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。,培养基的配制原则,营养成分,碳源 氮
5、源 矿物质 生长因子 水分,培养基的配制原则,碳源（carbon source）凡是提供微生物营养所需的碳元素（碳架）的营养源，称为碳源。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。微生物的碳源谱 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物、脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含氮的化合物。,培养基的配制原则,氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物
6、质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。无机氮源：碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素有机氮：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。生产上常用的氮源有硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高的鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。,培养基的配制原则,二.控制培养基的PH值 细菌与放线菌生长的pH在77.5之间， 酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液,培
7、养基的配制原则,三、渗透压,注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长,培养基的配制原则,四、氧化还原电位,氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。,培养基的配制原则,培养基的种类,据组成成分可分为: 1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。 从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入2%
8、左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。,按照培养基的用途，可将其分为 1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物 2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。 3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产
9、生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物,培养基的配制原则,培养基的配制方法和步骤,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用2MNaOH或2MHCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,配制方法和步骤,配制方法和步骤,配制方法和步骤,注意事项,培养基配方在附录 按照每组的安排来配制，每人配的不一定都相同 按照书上的比例，但总量有变
10、（所有配方均为1000ml量，同学们需要根据不同要求换算） 配溶液 调PH值 加琼脂粉 灭菌（在老师监督下进行） 普通微生物培养基配制可以使用自来水，在细胞培养以及分子试验中需要区别对待,实验程序2:分离培养微生物常用器皿的准备,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。,湿热灭菌法原理,湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固 湿热的穿透力比干热大，水的传热能力比许多非导体的固体强 湿热的蒸汽有潜热存在，1g水在100由液态变为固态可放出2.26kJ，可增强灭菌效果,培养基和玻璃器材的 灭菌方法,空气膨胀压大于水蒸气膨胀压,实验程序3:培养基和玻璃器材
11、的灭菌方法,干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 加压蒸汽灭菌法 其步骤如下： 1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2 , 0.1MPa）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持20-30min。 对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力(0.06MPa,约112.60C)，30min。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压
12、力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,培养基和玻璃器材的 灭菌方法,培养基和玻璃器材的灭菌方法,间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,紫外线灭菌法： 一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫
13、外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。,培养基和玻璃器材的灭菌方法,培养基配制的原则 配制培养基的配方，及方法 培养基蒸汽灭菌原理，方法,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,AmpR细菌的分离 培养基成分 牛肉膏 0.3g;蛋白胨 1g;氯化钠 0.5g;琼脂 2g;蒸馏水 100mL;pH 7.0
14、7.2;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min 用量： 100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组（涂布/划线） 制作斜面（只需1个组制备）：无需抗生素 配制方法,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基-2,配制方法 称量：按培养基配方比例依次准确称取。注意：牛肉膏、蛋白胨。 溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。 调pH：注意pH值不要调过头，以避免回调。 定容： 待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积。 加琼脂（固体培养基）： 加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。 分装、加塞、标记、包扎：分装入试管内或三角烧瓶内。注意：不要使培养基沾在管口或瓶口上。(1)液体分
15、装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 灭菌：121.3， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 抗生素等生物活性物质的添加：临用前加入，约55 ，按比列添加（终浓度10-60ug/mL）。 制作平板or斜面：搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 无菌检查：将灭菌的培养基放入37的温室中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。,马丁培养基,淀粉降解真菌的分离 培养基成分 葡萄糖 2
16、.5g 蛋白胨1.25g ； KH2PO43H2O 0.25g; MgSO47H2O 0.125g; 0.1孟加拉红溶液 0.83ml; 琼脂 3.85g; 蒸馏水 250ml; 自然pH; 用量： 250mL/行；制备12个平板；2个/人（涂布/划线） 制作斜面：无需抗生素 配制方法,马丁培养基-2,配制方法 称量： 称取培养基各成分的所需量。 溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。按每250ml培养基加入0. 83ml的0.1孟加拉红溶液。 定容： 待各成分完全溶化后，补足水量至所需体积。 加琼脂（固体培养基）： 加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。 分装、加塞
17、、标记、包扎。 灭菌：高压蒸汽灭菌1213，20min。 临用前，加热融化培养基，候冷至60左右，按每100ml培养基无菌操作加入2ml的2去氧胆酸钠溶液及0.33ml的链霉素溶液（10000 u/ml），迅速混匀。 制作平板or斜面 用量： 250mL/行；制备12个平板；2个/人（涂布/划线） 制作斜面（6支），4支无菌试管，1瓶 50ml 无菌水,高氏I 号培养基,产色素放线菌的分离 培养基成分 溶性淀粉 2g;KNO3 0.1g;K2HPO4 0.05g;MgSO47H2O 0.05g;NaCl 0.05g;FeSO47H2O 0.001g （母液）;琼脂 2g;自来水 100mL;p
18、H 7.27.4;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min 用量： 100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组（涂布/划线） 制作斜面（只需1个组制备）：无需抗生素 配制方法 微量元素（母液） pH,样品制备及目标微生物分离,梯度稀释：无菌操作称取检样25克土（或25mL），放入含有225mL灭菌水的玻璃三角瓶中(0.5g/5mL)，振摇30min，即为1：10稀释液，依次做1：100、1：1000稀释。 根据对样品污染情况的估计，选择2-3个合适的稀释度，涂布（100-200ul稀释液） or 划线（稀释原液） or 45 0C混合共培养（0.5-1.0 mL稀释液） 标记并培
19、养： 平皿底；平皿倒置；2837 恒温培养 细菌/真菌/放线菌=37/28/28 合理安排时间，协作 多余平板和斜面写上班级和组号，交汪老师供转接使用 准备下个班级公用实验材料（无菌水、三角瓶、试管等）,思考题,培养基中加琼脂的作用是什么？ 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有何不同？ 如何检查培养基灭菌是否彻底？,注意事项,培养基配方在附录 按照每组的安排来配制，每人配的不一定都相同 按照书上的比例，但总量有变（标准配方均为1000ml量，同学们需要根据不同要求换算） 配溶液 调PH值 加琼脂粉 灭菌（在老师监督下进行） 普通微生物培养基配制可以使用自来水，在细胞培养以及分子试验中需要区
20、别对待,加热的电炉在实验室的靠窗的地方 天平、电子天平 避免药品交叉污染（药匙、瓶盖、水等）,培养基配制，三角瓶的包装，试管的捆扎 了解、练习平板包装、吸管包装 了解干热灭菌，紫外灭菌， 使用高压蒸汽灭菌器,周一第5-8大节：细菌 周二第3-4大节：真菌 周五：放线菌,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（AmpR细菌） 高氏I 号培养基（放线菌） 马丁培养基（真菌）,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏 0.3g;蛋白胨 1g;氯化钠 0.5g;琼脂 2g;蒸馏水 100mL;pH 7.07.2;灭菌 1.05kg/cm2， 20-25min Amp在培养基冷却后加入马丁培养基：葡萄糖 1g蛋白胨;0.5g K
21、H2PO43H2O 0.1g;MgSO47H2O 0.05g;0.1孟加拉红溶液 0.33ml;琼脂 1.52g; 蒸馏水 100ml;自然pH;2去氧胆酸钠溶液 2ml（预先灭菌，临用前加入）;链霉素溶液（10000 u/ml） 0.33ml（临用前加入）高氏I 号培养基：溶性淀粉 2g;KNO3 0.1g;K2HPO4 0.05g;MgSO47H2O 0.05g;NaCl 0.05g;FeSO47H2O 0.001g （母液）;琼脂 2g;自来水 100mL;pH 7.27.4;灭菌 1.05kg/cm2，20-25min,PDA培养基 马铃薯 200克 葡萄糖 20克 琼脂 1520克 自来水 1000毫升 自然PH YPD培养基 酵母膏 1g 蛋白胨 2g 葡萄糖 2g 琼脂 1520克 自来水 1000毫升 自然PH,实 验 二,结 束,
