1、食品中常规项目的微生物检验,1食品中菌落总数的测定,菌落总数的定义 菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL或1cm2表面积检样中所含细菌菌落的总数。,测定原理：,菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分，培养温度和时间，PH，需氧性质等），所得1ml (g) 检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。,一、实验目的 1、学习或均技术的技术方法； 2、掌握
2、食品细菌总数的测定报告方式。 二、实验材料 1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄 2、培养基和试剂：75%乙醇、生理盐水、15%氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基,实验一 食品中细菌总数的测定,1、检验程序 菌落总数检验程序：检样做成几个适当倍数的稀释液选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内每皿内加入460C适量营养琼脂菌落数报告,三、实验方法,（1）以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的
3、灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r/min100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。 （2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。,2、检样稀释及培养,（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选
4、择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至460C营养琼脂培养基可放置在（461）0C）水浴锅内保温注入平皿15ml20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。（6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）0C恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。,3、菌落计算方法 （1）菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落
5、数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 平板菌落数的选择选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。,稀释度的选择应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生
6、长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四
7、舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。,2食品中大肠菌群的测定,大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在3724 h能分解乳糖产酸、产气、需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。,大肠菌群=大肠杆菌吗？,大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽孢杆菌。 大肠埃希氏菌(E. coli)习惯称为大肠
8、杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。,大肠菌群的卫生意义,大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。,国标法,国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养242h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色
9、观察。同时接种乳糖发酵管361培养242h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。,实验二 食品中大肠菌群的测定 一、实验目的 1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法； 2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。 二、实验材料 1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针 2、培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、远腾氏琼脂、革兰氏染色液,三、实验方法与步骤 1、采样及稀释 以无菌操作将检样25g（或25ml）
10、放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000r/min10000r/min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液,根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。 2. 乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发
11、酵乳糖产生气体的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置（361）0C温箱内，培养（242）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行,3.分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（361）0C温箱内，培养18h 24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。 4.乳糖复发酵试验即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。,
12、在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1 2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（361）0C的温箱内培养（242）h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。 5.报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。,3粪大肠菌群的检验,根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法(GB4789.3-2010)，粪大肠菌群系指一群能在44 24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。表8-3中的大肠艾
13、希氏菌I型即属粪大肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此，唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大肠菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌群数称为总大肠菌群数者。,实验三 霉菌和酵母菌的检验,仪器： 冰箱：25。 恒温培养箱： 281。 均质器。 恒温振荡器。 显微镜：10100。 电子天平：感量 0.1 g。 无菌锥形瓶:容量 500 mL、250 mL。 无菌广口瓶：500 mL。 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。 无菌平皿：直径 90 mm。 无菌试管: 10 mm75 mm。 无菌牛皮纸袋、塑料袋
14、。 培养基和试剂 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基 孟加拉红培养基,结果与报告 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均小于 10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于 1 计数。 报告 菌落数在 100 以内时，按“四舍五入“原则修约，采用两位有效数字报告。 菌落数大于或等于 100 时，前 3 位数字采用“四舍五入“原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数来表示结果；也可用 10 的指数形式来表示，此时也按“四舍五入“原则修约，采用两位有效数字。 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。,实验四 商业无菌,罐头食品的商业无菌是指罐头食品经过适度的热杀菌后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。罐头食品的商业无菌的检验适用于各种密封容器包装的，包括玻璃瓶，金属罐，软包装，经过适度的热杀菌后达到商业无菌，在常温下能较长时间保存的罐头食品。,
