1、Waterse2695型高效液相色谱仪操作规程目 的 ： 建 立 Waterse2695高 效液 相色 谱仪 标准 操作 规程 ， 为 了使 操作 者操 作高 效液 相色 谱仪更 规范 ，保 证实 验结 果更 精确 。 范 围： 适 用于 Waterse2695高 效液 相色 谱仪 操作 和维 护保 养。职 责 :新 药研 发部 人员 、 QC人 员对 本规 程的 实施 负责 。1开机前的准备工作1.检 查设 备电 源、 流路 、信 号连 接是 否完 好。1.2流 动相 ： 配 制相 应的 流动 相 ， 经 0.45m微 孔滤 膜抽 真空 过滤 后 ， 并 超声 脱气 5分 钟 ，必 须使 用
2、色 谱纯 的溶 剂 ， 水 或缓 冲盐 溶液 要用 超纯 水 ； 盛 放溶 液和 流动 相所 用的 玻璃 容器 必须 用超 纯水 清洗 。1.3样 品溶 液： 按方 法取 样或 配制 标准 样品 溶液 ， 0.45m滤 膜过 滤。2仪器的组成及开机平衡系统2.1仪 器组 成 。 本 仪器 由 waterse2695分 离单 元 、 2489紫 外可 见光 检测 器 、 Empower色 谱工 作 站 和 打 印 机 组 成 。 2695分 离 单 元 包 括 四 元 梯 度 洗 脱 的 溶 剂 输 送 系 统 ， 四 通 道 在 线 真 空脱 气机 ， 可 容纳 120个 样品 瓶的 自动 进
3、样 系统 ， 柱 温箱 ， 内 置的 柱塞 密封 垫清 洗系 统 ， 溶 剂托 盘， 液晶 显示 器， 键盘 用户 界面 及软 盘驱 动器 。 2.开 机。 先 打开 电脑 ， 依 次接 通 2695分 离单 元、 检测 器、 计算 机和 打印 机的 电源 。 接通 2695分 离单 元后 ， 约 20s仪 器开 始自 检 ， 约 1min后 ， 显 示主 屏幕 ， 此 时继 续各 部件的 初始 化， 待主 屏幕 上方 标题 区出 现 “ Idle” 时 ，仪 器进 入待 命状 态。2.3脱 气 （ Degasger） 。 按 面 板 右 下 方 “ Menu/Staus” 键 进 入 “ S
4、taus（ 1） ” 界 面 ，移 动光 标至 “ DegaserMode” ， 按 Enter选 择 “ On” ， 打开 在线 脱气 。一 般默 认是 开的 。2.4设 定柱 温及 样品 室温 度（ 可选 项） 。在 “ Staus” 界 面， 光标 至 “ ColHtrSet” ， 输入 目标 温度 ，按 Enter； 光标 移至 “ Sample” ,选 择目 标温 度（ 4 -40 ） ，按 “ Enter” 。（ 可在 工作 站方 法中 设置 ） 2.5灌 注柱 塞密 封清 洗泵 （ PrimeSalWash） 。 在 主屏 幕下 ， 按 “ Diag” ， 显 示 “ Diagn
5、osties”屏 幕， 按 “ PrimeSealWash” ,显 示 “ PrimeSealWash” 屏 幕， 按 “ Start” ,直 到清 洗溶剂 流出 泵杆 密封 圈冲 洗废 液管 ，依 次按 “ Halt” 、 “ Close” 、 “ Exit” 。2.6灌 洗针 头清 洗泵 （ PrimeNedleWash） 。 在 主屏 幕下 ， 按 “ Diag” ， 显 示 “ Diagnosties”屏 幕， 按 “ PrimeNdlWash” ,显 示 “ PrimeNedleWash” 屏 幕， 按 “ Start” ,30s内 应见溶 剂从 废液 排放 口流 出 ， 按 “ C
6、lose” 、 “ Exit” ； 若 想要 多清 洗几 次时 ， 请 按 “ StartAgain” 。2.7湿 灌注 （ WetPrime） 。 在 “ Staus(1)” 界 面中 “ Compositon” 下 ， 选 择将 用到 的溶剂 通道 为 “ 10%” ， 按 液晶 屏幕 右下 角 “ DirectFunction” 键 ， 移 动光 标选 择 “ WetPrime” ，“ OK” ， 流速 及时 间可 使用 默认 值， 也可 自行 设定 （如 ： 5ml/min， 3min） ， “ OK” 即 可。将 每一 个会 用到 的溶 剂通 道按 照上 述操 作一 次。 （也 可各
7、 通道 选 25%5ml/min， 3min） 。2.8冲 洗进 样器 （ PurgeInjector） 。 按 “ Menu/Staus” 进 入 “ Staus(1)” 画 面 ， 在 设定溶 剂画 面中 设定 适当 的流 速与 溶剂 比例 （ 针 对缓 冲盐 或离 子对 试验 ， 建 议设 定 50%乙 腈 ： 50%水 的溶 剂来 清洗 进样 器） ，按 “ DirectFunction” 键 ，选 择 “ PurgeInjector” ， “ OK” ，默 认数 值为 6， “ OK” 。注 ： 以 上 2.5-2.8为 溶剂 系统 前处 理过 程 ， 建 议每 天开 机后 依次 进
8、行 。 若 发现 注射 器中有 气泡 ，则 可重 复 2.8直 至排 除。2.9平 衡柱 子。 在 “ Staus” 界 面上 ，按 流动 相比 例设 定各 通道 溶剂 比例 后， 再 WetPrime操 作一 次， 然后 设置 流速 ，平 衡色 谱柱 30-60min。 （可 在工 作站 中设 置） 。3编辑仪器方法和方法组3.1打 开 电 脑 后 ， 双 击 桌 面 上 的 Em power， 输 入 用 户 名 sytem 、 密 码 m anger， 选 择 “ 运 行样 品 ” 。3.2新 建 仪 器 方 法 。 进 入 “ 运 行样 品 ” 后 ， 选 择 “ 创 建方 法组 ”
9、调 用方 法组 编辑 向导 。 出 现 “ 新建 方法 组 选 择仪 器方 法 ” ， 单 击 “ 新 建 ” 来 创建 新的 仪器 方法 ， 此 时出 现 “ 仪 器方 法编 辑器 ”界 面 ， 按 相关 的要 求填 写各 参数 ， 根 据需 要编 辑不 同的 方法 ， 编 辑完 毕后 单击 “ 文 件 ” ， “ 另 存为 ” 后 出现 “ 保 存仪 器方 法 ” 对 话框 ，输 入此 方法 用于 的测 定药 品名 称， 单击 “ 保 存 ” 。3.新 建方 法组 ：选 择所 需的 方法 名称 ，点 击 “ 下 一步 ” ， 输 入方 法组 名（ 与方 法名 一致 ） ， 即完 成方 法组
10、 的建 立。4进样4.1在 下面 的 “ 仪 器方 法 ” 里 选择 需要 仪器 方法 并点 击 “ 监 视器 ” 平 衡系 统， 观察 基线 。待 系统 平衡 后， 点击 “ 中 断样 品组 ” 开 关， 终止 观察 基线 。4.2当 进行 单进 样时 ，在 “ 运 行样 品 ” 的 “ 单 进样 ” 界 面中 输入 “ 样 品名 ” “ 功 能 ” “ 方法 组 ” “ 进 样体 积 ” “ 运 行时 间 ” 等 ；然 后点 击 “ 单 进样 ” 图 标， 或选 择上 方的 “ 进 样 ” ，再 选择 “ 进 样 ” ， 这 样就 开始 了单 次进 样 。 单 次进 样完 成分 析后 系统
11、 即停 止检 测 （ 流 动相 正常 流动 ） 。4.3当 多进 样时 ，在 “ 运 行样 品 ” 的 “ 样 品 ” 界 面点 击 “ 样 品瓶 ” 输 入所 有样 品分 别所 在位 置 （ 输 入所 在编 号 ） ， 接 着分 别设 定 “ 样 品名 称 ” 、 “ 进 样体 积 ” 、 “ 进 样数 ” 、 “ 功 能 ”等 采集 参数 ，在 “ 方 法组 ” 中 选择 需要 的方 法组 ，在 “ 运 行时 间 ” 中 设定 相关 的时 间。4.开 启绿 色 “ 运 行 ” 或 点击 “ 进 样 ” ， 在选 择 “ 运 行样 品组 ” ， 输入 样品 组名 称， 运行模 式（ 只运 行
12、） ，适 应性 模式 （出 错时 继续 ）， 点击 运行 。 4.5一 旦开 始运 行样 品组 ，画 面将 自动 切换 到 “ 正 在运 行 ” 窗 口。4.6如 果有 另外 一组 样品 需要 运行 的话 ，也 可返 回 “ 样 品 ” 表 单继 续编 辑新 的一 组样 品，随 后单 击 “ 运 行 ” ， 即可 在此 样品 组结 束后 继续 运行 新的 一组 。4.7如 需修 改正 在运 行样 品的 测试 样品 ，在 “ 运 行样 品 ” 的 “ 正 在运 行 ” 界 面， 点击 “ 编辑 ” 菜 单中 “ 改 变当 前运 行样 品的 信息 ” ， 点 击确 定 ， 修 改样 品以 后 ，
13、须 重新 点击 “ 运 行 ” 。5数据的处理5.1利用处理方法向导建立处理方法5.1单 击 Em power软 件 Pro界 面中 的 “ 浏 览项 目 ” 进 入数 据浏 览画 面， 开始 查找 数据 。5.12选 择 “ 通 道 ” ， 进 入 通 道 画 面 。 选 择 需 处 理 的 数 据 （ 一 般 是 表 样 ） ， 选 择 菜 单 “ 工 具 -查 看 ” 打 开。5.13出 现 “ 查 看 -主 窗口 ” ， 单击 菜单 “ 文 件 -新 建 -处 理方 法 ” ， 出现 新建 处理 方法 对话 框 ,在 “ 处 理类 型 ” 选 择 “ LC” ， “ 积 分算 法 ”
14、选 择 “ 传 统 ” ， 在 “ 使 用处 理方 法向 导 ” 前 面打 勾，然 后点 击 “ 确 定 ” 。5.14出 现 “ 积 分 -峰 检测 1” 画 面， 设定 峰宽 或者 接受 缺省 值， 单击 “ 下 一步 ” 。5.15在 “ 积 分 -峰 检测 2” 画 面， 设定 积分 阀值 或者 接受 缺省 值， 单击 “ 下 一步 ” 。5.16在 “ 积 分 -积 分区 域 ” 中 ，直 接输 入保 留时 间或 者用 鼠标 左键 拖拽 放大 选定 积分 区域 ，单 击 “ 下 一步 ” 。5.17在 “ 积 分 峰 剔除 ” 中 ，根 据需 要设 定最 小面 积或 最小 高度 ，或
15、 者不 作任 何改 变， 单击 “ 下 一步 ” 。5.18在 “ 校 正 -普 通 ” 页 中， 除有 特定 要求 外， 接受 缺省 选项 ，单 击 “ 下 一步 ” ,出 现对 话框 ，选 择 “ 否 ” 。5.19在 “ 校 正 -名 称和 保留 时间 ” 页 中 ， 在 “ 名 称 ” 栏 中 ， 输 入组 分的 名称 ， 或 不作 改动 ，单 击 “ 下 一步 ” 。5.10在 “ 校 正 -缺 省量 ” 页 中 ， “ 含 量 ” 和 “ 单 位 ” 栏 不填 ，单 击 “ 下 一步 ” 。5.11在 “ 校 正 -内 表样 ” 页 中， 接受 缺省 选项 （外 标校 正 ） ，
16、单击 “ 下 一步 ” 。5.12出 现处 理方 法名 对话 框， 在 “ 在 处理 方法 名 ” 中 输入 方法 名， 然后 单击 “ 完 成 ” 结束 处理 方法 向导 。 5.13再 次出 现主 窗口 ， 下 部的 “ 峰 ” 表 中出 现积 分结 果 ， 并 在状 态条 中显 示新 处理 方法 名称 。然 后打 开菜 单 “ 文 件 -保 存 -全 部 ” ， 进行 保存 ，最 后关 闭窗 口。5.14回 到 “ 浏 览项 目 ” 里 面 ， 选 择 “ 方 法 ” ， 然 后 “ 更 新 ” ， 刚 建立 的处 理方 法就 出现 在里面 。 5.2直接建立处理方法5.21单 击 Em
17、 power软 件 Pro界 面中 的 “ 浏 览项 目 ” 。5.2选 择 “ 文 件 -新 建方 法 -处 理方 法 ” ， 进 入 “ 新 处理 方法 ” 对 话框 ， 在 “ 处 理类 型 ” 选 择“ LC” ， “ 积 分算 法 ” 选 择 “ 传 统 ” ， 单击 “ 确 定 ” 。5.23进 入 “ 处 理方 法编 辑器 -LC处 理方 法 ” 窗 口 ， 分 别在 “ 积 分 ” 、 “ 平 滑 /偏 移 ” 、 “ 组 分 ” 、“ 峰 比率 ” 、 “ 缺 省含 量 ” 、 “ 命 名组 ” 、 “ 定 时组 ” 、 “ 适 应性 ” 、 “ 限 制 ” 、 “ 噪 音与
18、 漂移 ” 根 据图 谱处 理需 要设 定相 关的 参数 。5.24相 关的 参数 设定 后， 选择 “ 文 件 -另 存为 ” ， 在 “ 保 存当 前的 处理 方法 ” 的 对话 框里 输入 此处 理方 法的 名称 ，单 击 “ 保 存 ” 。5.25回 到 “ 浏 览项 目 ” 里 面， 选择 “ 方 法 ” ， 然后 “ 更 新 ” ， 刚建 立的 处理 方法 就出 现在 里面 。 5.3定量计算5.31回 到 “ 通 道 ” 选 项卡 ，选 中要 处理 的样 品， 然后 单击 “ 处 理 ” 。5.32出 现 “ 后 台 处 理 报 告 ” 对 话 框 ， 在 “ 处 理 ” 中 ，
19、 选 “ 使 用 指 定 的 处 理 方 法 ” ， 并 在 下拉 菜 单 中 选 择 建 立 的 处 理 方 法 。 在 “ 清 除 校 正 ” 方 框 中 打 勾 ， 并 使 “ 打 印 ” 和 “ 导 出 ” 方 框中 为空 ，单 击 “ 确 定 ” 。5.3回 到 “ 结 果 ” 选 项卡 ， 单 击 “ 更 新 ” 键 更新 结果 。 双 击即 可浏 览色 谱图 和 “ 峰 ” 结 果 ，查 看计 算的 “ 含 量 ” 结 果。6数据报告的打印6.1单 击 Em power软 件 Pro界 面 中 的 “ 浏 览 项 目 ” ， 选 择 所 要 打 印 数 据 所 在 的 项 目 后
20、 ， 单 击“ 确 定 ” ， 进入 项目 浏览 画面 。6.2在 “ 结 果 ” 选 项卡 中选 择欲 打印 的结 果， 选择 菜单 “ 工 具 -预 览 /出 版 ” 。6.3出 现 “ 打 开报 告方 法 ” 对 话框 ，在 “ 使 用以 下的 报告 方法 ” 下 拉菜 单中 选择 “ 峰 综合 报告 ” ， 然后 单击 “ 确 定 ” 。6.4在 屏幕 上即 出现 报告 预览 窗口 ， 如 预览 后无 误 ， 选 择菜 单 “ 文 件 -打 印 ” 或 单击 打印 的图标 ，打 印报 告。 7关机7.1使 用完 毕后 ， 按 规定 用适 当的 溶剂 冲洗 色谱 柱 、 系 统管 路 、
21、 自 动进 样器 、 进 样针 和柱 塞杆 密封 垫。 7.2确 保 2695分 离单 元已 彻底 冲洗 干净 后， 关闭 电源 开关 ， 关 闭计 算机 及显 示器 电源 。填 写使 用及 维修 保养 记录 。8仪器 设备的维护和保养8.1色 谱柱 日常 维护8.1长 期不 使用 HPLC， 应 该将 色谱 柱从 系统 拆除 ， 拆 除前 应该 充分 平衡 色谱 柱 ， 一 般为 用甲 醇或 乙腈 冲洗 色谱 柱 40分 钟以 上 。8.12每 次开 机时 ，流 速和 柱压 要逐 渐加 强， 突增 压会 使柱 庆受 到冲 击引 起紊 乱， 产生 空隙 ，使 柱头 凹陷 。 8.13在 注 射
22、 样 品 前 要 使 色 谱 系 统 平 衡 。 若 色 谱 柱 长 期 保 存 未 使 用 ， 则 刚 装 入 HPLC系 统 时应 以 流 量 0.2mL/min平 衡 过 夜 （ 注 意 断 开 检 测 器 避 免 不 必 要 的 检 测 器 耗 损 ） ， 然 后 再 以0.8mL/min流 量 平 衡 30分 钟 以 上 。 以 低 流 量 缓 慢 的 提 高 流 速 直 到 获 得 稳 定 的 基 线 ， 这 样 可 以保 证色 谱柱 的使 用寿 命 。 当 然在 分析 结束 时冲 洗色 谱柱 及系 统后 停止 流量 时也 应该 从高 流量 逐步 过渡 到低 流量 直到 流量 为
23、0。8.14不 要把 柱头 拧得 太紧 ， 过 紧易 损坏 接头 螺纹 引起 渗漏 。 拧 螺丝 时使 用的 搬手 应短 些 ，不 宜太 长 。 不 要把 柱子 放在 有气 流的 地方 或直 接放 在阳 光下 ， 气 流和 阳光 都会 使柱 子产 生温度 梯度 ， 造 成基 线漂 移 。 若 怀疑 基线 漂移 是由 温度 梯度 造成 的 ， 可 设法 使柱 子绝 热 ， 例 如用恒 温炉 或恒 湿水 套使 之恒 温， 也可 用布 或毛 巾把 柱子 和接 头包 起来 。8.15若 仪器 用来 作常 规分 析， 可配 制一 根专 用柱 ，这 样有 助于 延长 柱子 的寿 命。8.16若 所注 样品
24、 会污 染柱 子 ， 可 用适 当的 溶剂 （ 几 百毫 升 ） 慢 慢冲 柱子 过夜 。 使 用再 用流 动相 重新 平衡 柱子 30分 钟。8.17装 卸 、 更 换 、 贮 存需 挪动 柱子 时 ， 动 作宜 轻 ， 不 使其 受到 碰撞 ， 以 免柱 床因 震动 而产 生空 隙或 通道 。 8.18使 用硅 胶为 基底 的柱 子， 流动 相的 pH值 一般 不应 8或 2， pH 8会 使硅 胶骨 架溶 解； pH 2则 键合 相化 学键 易剥 离。8.19色 谱柱 在使 用过 程中 ，柱 压逐 步升 高， 可能 有两 个原 因： 柱 子被 污染 或有 固体 析出 造成 流路 堵塞 ，
25、 固 定相 颗粒 被碎 或骨 架被 溶解 。 解 决的 办法 ： 在 分析 柱前 加一 根短 保洗 柱 （ 内 径 4 50m） ， 里 面 的 填 料 应 与 分 析 柱 相 同 ； 避 免 使 用 碱 性 强 的 流 动 相 ； 如 果柱 头部 分被 污染 ，可 将柱 头部 分变 色的 固定 相刮 去， 另加 一些 新的 作为 补充 。 8.10含 盐 的 流 动 相 的 冲 洗 方 法 ： 每 天 操 作 结 束 后 ， 先 用 纯 化 水 或 含 甲 醇 5%（ 最 高 浓 度在 20%以 下） 的水 冲洗 时间 约 20 30分 钟， 再用 高浓 度甲 醇（ 含甲 醇 85%以 上）
26、 溶液 冲洗 ，约 30 60分 钟 (注 ： 不 能直 接用 有机 溶液 冲洗 ， 盐 类易 析出 ， 堵 塞色 谱柱 ， 造 成色 谱柱 永久性 损坏 ；所 用水 最好 是重 蒸馏 的水 ，必 须抽 滤和 脱气 )。8.11不 含盐 的流 动相 的冲 洗方 法： 每天 操作 结束 后， 先用 流动 相冲 洗约 10 15分 钟，再 用含 5%甲 醇的 水冲 洗 10 20分 钟。 最后 用高 浓度 甲醇 （含 甲醇 85%以 上） 溶液 或纯 甲醇冲 洗， 时间 约 20 30分 钟（ 注： 不能 直接 用纯 水冲 洗， 易造 成流 动停 止 ） 。8.12柱 要加 标签 ，新 旧分 开，
27、 不要 放大 温差 大的 地方 。8.2e2695分 离单 元的 维护8.21流 动相 使用 不要 超过 二天 ，最 好每 天新 鲜配 制以 免微 生物 的生 长。8.2腐 蚀性 溶剂 或缓 冲液 在泵 内存 放不 可过 夜， 否则 溶剂 会对 泵起 腐蚀 作用 。使 用腐 蚀性物 质后 要冲 洗 ， 先 用水 后用 甲醇 。8.23进 行阀 注射 孔的 导管 内端 是一 个聚 四氟 乙烯 材料 做的 钵形 垫圈 （ 或 平垫 圈 ） ， 作 用是 保证 样品 液全 部注 入系 统而 不外 汇 。 导 管不 宜审 批权 得太 紧 ， 否 则垫 圈被 挤压 过度 而封 死 ， 无 法进 样 。
28、进 样阀 的通 道十 分微 细 ， 稍 有脏 物即 易堵 塞 ， 所 以 ， 样 品预 先处 理很 重要 。 样 品一 定要溶 解完 全 ， 同 时避 免注 射浓 溶 液 ， 以 免残 留液 在进 样阀 内析 出结 晶引 起堵 塞 ， 使 系统 压力 异常上 升。8.24系 统短 期不 使用 ，应 该在 每次 使用 后冲 洗系 统 30分 钟以 上 。8.25注 射器 中的 气泡 快速 有效 排除 方法 ：可 以小 心的 卸下 注射 器抽 吸甲 醇排 除气 泡后 ，注射 器 中 保 留 少 量 溶 剂 ， 做 “ purgeinjector” 小 心 安 装 上 ， 再 做 几 次 “ pur
29、geinjector” 观 察 没 有气 泡即 可。 其他 方法 ，可 以在 “ purgeinjector” 开 始后 、注 射器 杆向 上时 ，拧 掉下 边螺 丝 ， 上下 抽推 排除 气泡 ， 但 手动 排泡 过程 要在 “ purgeinjector” 结 束前 完成 。 溶 剂用 甲醇 较好 ， 不 用同 时拧 掉上 方注 射器 。8.3检 测器 的维 护8.31异 常峰 和噪 音 ， 对 于异 常峰 和方 形峰 以及 噪声 异常 增大 现象 ， 表 示光 源灯 已到 极限 ，应 更换 并检 查上 述现 象是 否消 失 。 若 流动 相被 污染 ， 也 会出 现异 常峰 和方 形峰
30、的情 况 。 流 动相 内混 有气 泡可 出现 流动 池内 有气 泡的 现象 ， 气 泡去 除方 法 ： 一 面由 泵送 液 。 一 面用 手指 紧压 流动 池出 口的 连接 管， 使池 内增 压， 如此 反复 3 4次 ，气 泡即 可冲 走。 注意 不应 使流 动池 压力 增加 太多 ， 以 免破 裂 。 流 动池 漏液 或池 出口 反压 过大 ， 环 境温 度起 落大 （ 如 直接 有风吹 在示 差折 光检 测器 上 ） ， 都可 能发 生流 动池 漏液 ，池 出口 反压 过大 及温 差大 的现 象。 若流动 池出 口反 压太 大， 可检 查流 路是 事畅 通， 或更 换内 径粗 一些 的出 口连 接管 。8.32基 线漂 移： 样品 池、 参比 池被 污染 ，可 用溶 剂清 洗检 测池 ，但 所用 溶液 和原 来使 用的 流动 相互 溶， 或采 用溶 剂过 度的 方式 。若 池子 太脏 ，可 用 10%HNO3和 蒸馏 水清 洗。 另外 ，色 谱柱 污染 ， 不 断有 杂质 从柱 上洗 下 ， 也 会引 起检 测器 讯号 的噪 音和 漂移 。 环 境温 度变 化也会 引起 漂移 。9相关记录设 备使 用及 日常 维修 、保 养记 录 （ JL-SMP.ED.08-02）
