1、ICS 11.220B 41DB 37山 东 省 地 方 标 准DB37/T 30052017猪流行性腹泻病毒分离与 RT-PCR 检测技术Technology of Isolation and RT-PCR detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus2017-08-18 发布 2017-09-18 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB37/T 30052017前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧
2、兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、李俊、杜以军、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。DB37/T 300520170猪流行性腹泻病毒分离与 RT-PCR 检测技术1 范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术的要求。本标准适用于猪肠道内容物、排泄物或乳汁样品中猪流行性腹泻病毒的分离与检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略
3、语适用于本文件。DEPC水：DEPC（Diethy pyrocarbonate）处理并灭菌后的去离子水。DMEM：细胞培养基（Dulbeccos Modified Eagles Medium）。PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus）。双抗：青霉素、链霉素混合液（Penicillin-Streptomycin Solution）。CPE：致细胞病变效应（cell cytopathic effect）。4 仪器与试剂除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法，所用化学试剂应为分析纯。4.1 病毒分离需要的仪器
4、与试剂4.1.1 微量可调移液器（最大量程为 10 L、20 L、100 L、1000 L）。4.1.2 20000 g 高速冷冻离心机。4.1.3 高压灭菌锅。4.1.4 37 二氧化碳细胞箱。4.1.5 II 级生物安全柜。4.1.6 超低温冰箱：可控温至-70 。4.1.7 PBS。4.1.8 双抗（100）（青霉素 10000 IU/mL，链霉素 10000 g/mL）。4.1.9 DMEM 培养基。4.1.10 Vero 细胞。4.1.11 新生胎牛血清。DB37/T 3005201714.1.12 胰酶。4.1.13 一次性 25 cm2细胞培养瓶。4.1.14 一次性 10 mL
5、 吸管。4.1.15 一次性 0.22 m 滤器。4.1.16 1.5 mL 离心管。4.2 RT-PCR 检测需要的仪器与试剂4.2.1 微量可调移液器（最大量程为 10 L、20 L、100 L、1000 L）。4.2.2 20000 g 高速冷冻离心机。4.2.3 PCR 仪。4.2.4 高压灭菌锅。4.2.5 普通冰箱。4.2.6 超低温冰箱：可控温至-70 。4.2.7 PBS。4.2.8 1.5 mL 离心管。4.2.9 阳性对照：PEDV CV777 疫苗毒株。4.2.10 阴性对照：DEPC 水。4.2.11 引物：采用套式 PCR 进行扩增，设计 2 对引物。PEDV 外 F
6、 5-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3，PEDV 外 R 5-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3，PEDV 内 F 5-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3，PEDV 内 R 5-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3。5 方法5.1 样品采集5.1.1 活体采样采集腹泻猪的排泄产物0.5 g0.7 g或采集乳汁0.5 mL0.7 mL。5.1.2 病死猪采样采集小肠肠道内容物1 g1.2 g。5.2 样品处理将样品按1:4的比例加入PBS，混匀并反复冻融23次后，以2000 r/min，4 离心5 min，取上清，12000 r/min 4 离心15 mi
7、n，收取上清，过滤除菌置于-70 保存备用。5.3 病毒分离与鉴定取24 h生长良好的Vero单层细胞，弃掉培养液，用PBS洗细胞2次，按照每25 cm2培养瓶中加入200 L的比例添加处理好的上清，同时加入终浓度为5 g/mL的胰酶，37 吸附1 h（注意期间每隔20 min轻摇一次）。之后加入终浓度为5 g/mL胰酶的维持液（不含血清）。 37 培养3 d，其间逐日观察。传代的细胞培养物反复冻融3次，收取病毒液。用同样的方法盲传3代。每次传代均设不接病毒但含相同胰酶浓度的对照组细胞。鉴定方法详见5.4。5.4 病毒 RT-PCR 检测技术DB37/T 3005201725.4.1 样品 R
8、NA 的提取5.4.1.1 取 250 L 处理后的样品或病毒培养物于 1.5 mL 离心管中，加入 750 L Trizol 充分混匀，冰上静置 5 min。5.4.1.2 加入 200 L 三氯甲烷，剧烈震荡混匀，冰上放置 5 min 后，以 12000 rpm 4 离心 15 min。5.4.1.3 吸取 500 L 上清转移至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积异丙醇。-20 放置 20 min，以12000 rpm 4 离心 15 min。5.4.1.4 弃去上清，用 1 mL 预冷的 75 %乙醇轻轻冲洗 1.5 mL 离心管，以 12000 rpm 4 离心 5 min。5.4
9、.1.5 弃去上清，以 7500 rpm 4 离心 5 min，吸取残留液体，在冰盒上静置 5 min15 min，使 RNA 干燥。5.4.1.6 加入 20 L DEPC 水溶解 RNA。立刻进行反转录，剩余 RNA -70 保存。5.5 第一链 cDNA 合成5.5.1 反转录反应体系反转录反应体系，详见附录B.15.5.2 反转录反应程序将配好的反应体系轻轻混匀，如用Oligo(dT)18(0.1 g/L)，42 孵育30 min。如用Random Primer(N 9)(0.1 g/L)，25 孵育10 min，42 孵育30 min。85 加热5 min灭火反转录酶。5.5.3 P
10、CR 的条件取1/10-1/5体积（2 L4 L）的反转录产物为PCR模板。每次PCR均应设立阳性对照与阴性对照具体参数详见附录B.2。外PCR反应条件：95 ，5 min；94 ，30 s；55 ，30 s；72 ，30 s；30 cycle；72 ，10 min。进行内PCR反应时，以外PCR产物为模板，进行套式扩增，反应条件与外PCR的反应条件一致。6 结果判定6.1 病毒分离检测阴性对照应无CPE出现；样品接种细胞出现CPE，进一步做RT-PCR检测。6.2 样品检测阳性对照有420bp条带出现，阴性对照无420bp条带出现，实验成立。样品出现420bp条带判为阳性，没有420bp条带
11、判为阴性。DB37/T 300520173A A附 录 A（资料性附录）试剂的配制A.1 75 %乙醇无水乙醇 75 mLDEPC水 25 mLA.2 1 %琼脂糖凝胶琼脂糖 0.6 g0.5TAE缓冲液 60 mLA.3 细胞生长液含10 %的胎牛血清和1 %双抗的DMEM。A.4 胰酶称取10 mg溶于10 mL去离子水中，充分溶解后0.22 m滤器过滤除菌，分装灭菌的1.5 mL离心管，-20 保存。A.5 接种病毒后维持液含1 %双抗的DMEM（不含血清）。DB37/T 300520174B B附 录 B（规范性附录）RT-PCR 反应体系B.1 反转录反应体系表 B.1 反转录反应体
12、系成分 1 2TS Reaction Mix 10 LRandom Primer(N19)(0.1 g/L) 1.0 L成分 2or Oligo(dT)18(0.1 g/L) 1.0 L成分 3 EasyScriptTM RT Enzyme Mix 1.0 L成分 4 RNA 50 ng5 g成分 5 DEPC 水 补至 20 LB.2 PCR反应体系表 B.2 PCR 反应体系成分 1 cDNA 2L4 LForward Primer (10 M) 1.0L2.0 L成分 2Reverse Primer (10 M) 1.0L2.0 L成分 3 2TransTaq HiFi PCR Super Mix 25.0 L成分 4 DEPC 水 补至 50 LB.3 PCR反应程序表 B.3 PCR 反应程序温度 时间步骤 1 95 5 min94 30 s55 30 s步骤 272 30 s步骤 5 72 10 min步骤2共运行30个循环。_
