1、l 0. l 0.hh1024 中国卫生检验杂志 2011 年 4月 第 21卷 第 4 期 Ch inese Journal ofH ealth Laboratory T echnology, Apr 2011; V ol 21 No 4经验交流关于食品安全国家标准 BG4789. 10- 2010金黄色葡萄球菌检验方法的探讨吴凤云, 张连娟, 张博( 内蒙古通辽市疾病预防控制中心, 内蒙 通辽 028000) 关键词 金黄色葡萄球菌; 金黄色葡萄球菌的鉴定 ; 葡萄 球菌 中图分类号 T S201. 3 文献标识码 C 文章编号 1004- 8685( 2011) 04- 1024- 02
2、由于食 品 在加 工、运 输、销 售中 易 被金 黄 色 葡萄 球 菌污染, 极易造成食物中 毒, 引起 突发 公共 卫生 事件, 所 以金 黄色葡萄球菌的检验方法变得日 趋重要。 国家标 准检验方 法的不断修订, 要求我 们更 加 深入 地 学习 和探 讨 BG 4789. 10- 2010金黄色葡萄球菌检验 方法。胶样的硬度, 偶然会遇到非脂肪溶 解的类似 菌落; 但无 混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干 燥食品 中所分 离的菌 落比典型菌落所产生的 黑色 较淡 一些, 外 观可 能粗 糙并 干燥。 在血平板上, 形成菌落较大, 圆形、光滑突起、湿润、金黄 色 ( 有时为白色 ), 菌落周
3、围可见完全透明溶 血圈。挑取上 述菌落 进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。1 设备与材料 3. 1. 1. 5 鉴定 染色镜检: 金黄 色葡萄 球菌为 革兰氏 阳性菌1. 1 设备二级生物 安全 柜、恒温 培养 箱、冰箱、电 子天 平、均质 器、吸管、玻璃器皿通过 质检 部门 年度 核查; 一 次性 无菌 接种 环、球菌, 排列成 葡萄 球状, 无 芽孢, 无荚 膜, 直径 约为 0. 5 m 1 m。血浆凝固酶实验: 挑 取 Ba ird- Pa rker平板 或血 平板 上可 疑菌一次性无菌平皿进行 了无菌核查。 落 1个或以 上, 分别接种 到 5 m l BH I和营 养斜面, 36 1
4、1. 2 培养基和试剂使用培养基、生化试剂由北京陆桥技术有限公司生产, 在有效期内使用。羊血是北京兰伯瑞生物技术有限责任公司提供。金黄色葡萄球 菌标准 菌株: 中国 CDC 营养与 食品 安全所培养 18 h 24 h。取北京陆桥公司生产冻干血 浆按说 明书操 作做血 浆凝固酶实验。如果结 果可 疑, 挑 取 营养 琼 酯 斜面 的 菌落 到 5 m l BH I,提供 36 1 培养 18 h 48 h, 重复实验。3. 2 G B4789. 10- 2010金黄色葡萄球菌检验之第二法 金黄色2 样品来源 葡萄球菌 Ba ird- P arker平板计数国家食品安全 风险监 测内蒙古 通辽市
5、 CDC 监 测点: 冰激 3. 2. 1 样品的稀释 称取 25 g 样品置盛 有 225 m l生 理盐水凌 17个样 品、即食非 发酵 性豆制 品 25个样 品、沙 拉 18 个样品、鲜榨果汁 18个 样品、中式凉 拌菜 17个样 品、熟肉 制品 40个样品、速冻熟制米面制品 15个样品, 共 150个样品。3 方法的均质袋中, 用拍击式均质器拍打 10 m in, 制成 1 10的样品匀液。用 1 m l无菌吸管吸取 1 10样品匀液 1 m ,l 沿管壁 缓慢注于盛有 9 m l稀释液的无 菌试管 中, 振 摇试管 或换取 1 支 1 m l无菌吸管反复吹打使其混合均匀, 制成 1
6、100的样品均液。按此方法制备 10倍系列样品匀液 。3. 1 G B4789. 10- 2010金黄色葡萄球菌检验之 第一法金黄色 3. 2. 2 样品的接种 选择 2 3个适宜稀释度的样品匀液, 在葡萄球菌定性检验 进行 10倍递增稀释时, 每个稀释度分别吸取 1 m l样品 匀液以3. 1. 1 样品的 处理 称取 25 g 样品至盛有 225 m l 7. 5% 氯化 0. 3 m 、 3 m 、 4 m l接 种量 分别加 入三 块 Ba ird- P arker平钠肉汤的无菌袋内, 用拍击式均质器拍打 10 m in。 板, 然后用无菌 L 棒涂布 整个 平板, 注 意不 要触 及
7、平 板边 缘。3. 1. 1. 2 增菌和分 离培养 将上述 样品匀液与 36 1 培 使用前 Ba ird- Pa rker平板表 面有 水珠 , 可放 在 25 50 的养 18 h 24 h。金黄色葡萄球菌在 7. 5% 氯化钠肉汤中呈混浊 培养箱里干燥, 直到平板表面的水珠消失。生长。 3. 2. 3 培养 在通常情 况下, 涂布后, 将 平板静 止 10 m in, 如3. 1. 1. 3 在将上述培养物, 分别划 线接种 到 Baird- P arker平板和血平板, 血平板 36 1 培养 18 h 24 。 Ba ird- Pa r果样液不吸收, 可将平板放在培养箱 36品匀液
8、吸收后翻转平板, 倒置与培养箱 361 培 养 1 h; 等样1 培养 45 hker平板 36 1 培养 18 h 24 h或 45 h 48 。3. 1. 1. 4 金黄 色 葡萄 球 菌 Ba ird - P arker 平板 上 , 菌 落 直径48 h。3. 2. 4 典型菌落计数和确认 金黄色葡萄球菌 Ba ird- Parke r2 mm 3 mm 颜色呈 灰色到黑 色, 边缘为 淡色, 周围为 一混浊带, 在其外层有一 透明圈。 用接 种针 接触 菌落 有似 奶油 至树平板上, 菌落直径 2 mm 3 mm 颜 色呈灰色 到黑色, 边 缘为淡色, 周围为一混浊带, 在其外 层有
9、一透 明圈。用 接种针 接触菌落有似奶油至树胶 样的 硬度, 偶 然会 遇到 非脂 肪溶 解的 类似作者简介 吴凤云 ( 1963 - ), 女, 副主任检验 师, 主要从事微生物检验工作。菌落, 但无混浊带及 透明 圈。长 期保 存的 冷冻 或干 燥食 品中所分离的菌落比典 型菌 落所 产生的 黑色 较 淡一 些, 外观 可能中国卫生检验杂志 2011年 4 月 第 21卷 第 4期粗糙并干燥。C h inese Jou rnal ofH ea lth Laboratory Technology, Ap r 2011; Vol 21 No 4表 2 金黄色葡萄球菌第二方法结果1025选择有典
10、型 菌落 的金黄 色葡 萄球 菌的 平板, 且 同一 稀释度 3个平板所有菌落 合计在 20 CFU 200 CFU 之间的平板计数。从典型菌落中任 选 5个菌落 (小于 5个全选 )分别按 3. 1.1. 5做血浆凝固酶实验。3. 2. 5 结果计算公式 ( 1) T = A B /C d公式 ( 2) T = ( A 1B1 /C1+ A 2B2 /C2) /1. 1d4 结果用第一方法鉴定 溶血、血浆 凝固酶 阳性结 果检出 13株金黄色葡萄球菌, 见表 1。按第 二法: 在 Ba ird- P arker平 板上挑取典型可疑金黄色葡 萄球菌菌落, 做血浆 凝固酶 实验, 结果有15株金
11、黄色葡萄 球菌。把 用第一 法检 出 13 株和 第二 法检出15株做甘 露醇发酵实 验, 甘 露醇阳性有 12株, 见表 3, 综合以上鉴定结果, 检出 12株是金黄色葡萄球菌。编号0102030405060708091011121314151617样品名称奶油冰激凌草莓冰激凌草莓冰激凌巧巧克力冰激凌菠萝冰激凌草莓冰激凌大豆腐大豆腐大豆腐大豆腐干豆腐大豆腐豆腐皮苏机豆腐干水果沙拉凉拌土豆丝香辣菠菜B aird - Parker平板(典型菌落 )+血浆凝固酶-+结果-+表 1 金黄色葡萄球菌第一法: 结果 标准菌株 26003 + + +血平板 血浆 Baird - Parker平板 血浆 合
12、计 17株 15株 15株编号 样品名称 结果(溶血 ) 凝固酶 (典型菌落 ) 凝固酶01 奶油冰激凌 + - + - - 表 3 甘露醇发酵试验02 草莓冰激凌 + - + - - 阳性菌株 甘露醇阳性 结果03 草莓冰激凌 + + + + +040506巧克力冰激凌菠萝冰激凌草莓冰激凌+-+-+-+-第一法第二法对照1315标准菌株 260031212+1212+07 大豆腐 + + + + +08091011121314151617标准菌株合计大豆腐大豆腐大豆腐干豆腐大豆腐豆腐皮苏机豆腐干水果沙拉凉拌土豆丝香辣菠菜26003+-+15 株+-+15株+-+17 株+15株+-+13株每
13、年发生的此类 事件 也比 较多。国 家非 常 重视 食品 安全, 在2010年修订了食品中金 黄色 葡萄球 菌检 验方 法, 撰 写本 文主要目的是 G B4789. 10- 2010对金黄色葡 萄球菌 的鉴定 缺乏严谨性。尤其是第二法直接在 Ba ird- Parke r平板挑取有 典型菌落革兰氏染色阳性, 呈葡萄状, 血 浆凝固 酶阳性 就可以 鉴定金黄色葡萄球菌, 就更 缺乏 科学 性。血 浆凝 固酶 阳性 的葡 萄球菌有金黄色葡萄球 菌、中间 型葡 萄球 菌、家 畜葡 萄球 菌, 怎么区分呢? 可以做以下实验: D - 甘露醇、半乳糖苷酶、V. P、麦芽糖生化鉴定; 还可以做 PYR
14、实验、粘联实 验, 就能区 分金 黄色葡萄球菌、中 间型葡萄球菌、家畜葡萄 球菌。甘 露醇分 解在厌氧条件下金黄色葡 萄球 菌阳 性, 表皮 葡萄 球菌 及腐 生葡 萄球菌阴性 3 。 1974年 Be rgey细菌学鉴定手册 ( 8版 )结合 是否产生凝固酶, 分解甘露 醇能力 , 有 无 A 蛋白 及 DNA 酶 和酯 酶产5 讨论17株菌株通过 革兰氏 染色 是阳性, 葡 萄状 球菌、溶血、血浆凝固酶阳性, 甘露醇阳性鉴 定 12 株金黄 色葡萄 球菌。金黄色葡萄球菌在自然界中无 处不在, 空气 、水、灰尘、人及 动物的排泄物中都可以找到 。金黄色 葡萄球 菌污染 食品一般 是通过食品加
15、工人员、炊事员或销售人员 带菌造 成的; 食品在 加工前带菌, 或在加工过程 中受 到了 产生 了肠 毒素, 引 起食 物中 毒。熟食制品由于包装、运输过程中受 到污染, 奶 牛患化脓 性乳腺炎、禽畜局部化脓时对肉体其 他部位造 成的污 染。近年 来, 美国疾控中心报告, 由金黄色葡萄球 菌引起 的感染 占第二 位, 仅次于大肠杆菌。在美国由金黄 色葡萄 球菌肠 毒素引起 的食物中 毒, 占 整个细 菌性食物 中毒的 33% , 加拿 大占到 45% , 我国生情况将葡萄球菌 分为 金黄 色葡萄 球菌 、表皮 葡萄 球菌 及腐生葡萄球菌 1 。 1994年 Bergey 细 菌 学鉴 定手 册 ( 9 版 ) 增至40个种, 截止 1995年已 有 78个种 2 。这 是在 工作 中的 一点体会, 和大家一起探讨, 望指正。参考文献 1 R. E. 布坎南、 N. E. 吉 本斯等伯 杰细 菌鉴定 手册 M . 第 8 版 . 北京: 科学出版社, 1984. 2 王秀茹. 预防医学与微生物学及检验技术 M . 北京: 人民 卫生出版社, 2002. 3 李仲三, 邢玉兰, 录文彬, 等. 卫生防疫微生物 检验操作 规程 M .北京: 北京出版社, 1991.(收稿日期: 2011- 01 - 04)
