1、荧光光度分析法,Fluorescence analysis,概 述,光致发光：有些物质收到光照射时，除吸收某种波长的光外，还会发出比原来吸收管的波长更长的光。 荧光（fluorescence）:物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发出的光。 分子荧光光谱法：又称荧光光谱法或荧光分析法,是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析,以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析。,一种物质能否发射荧光取决于它的分子结构和它所处的环境,发生荧光的必要条件,荧光法与紫外可见法的比较,荧光分析的基本原理,一 荧光和磷光的产生在光线照射下，一小部分的分子吸收了
2、能量，跃迁至较高能级而成为激发态分子。这部分激发态分子不稳定，在很短的时间内，首先因撞击以热的形式损失去掉一部分能量，从所处的激发能级降至第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这一能级下降至基态的任何振动能级。在后一过程中，激发分子以光的形式放出它们所吸收的能量，发出的光称为荧光。,激发态分子在下降至第一激发态的最低振动能级后，并不直接由此下降到基态的任何振动能级，而是转入亚稳态的三重态。在这里逗留的时间较长（有时长达1s以上），然后再由这里下降到基态的任何振动能级。从三重态降到基态所发出的光为磷光。 因激发态分子在三重态逗留的时间稍长，有时在入射光光源关闭之后，还存在磷光。而荧光因激发态分子
3、在很短的时间内便下降至基态，所以入射光源关闭后荧光立即消失,分子的激发态单线激发态和三线激发态,“三线激发态” 比 “单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态 单线态过程的 10-610-7。,分子结构与荧光的关系,发射荧光的两个条件 强的紫外-可见吸收；一定的荧光效率 1.跃迁类型,将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光而减弱荧光的，双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之荧光减弱,荧光光度计,荧光光度计及荧光测定方法,荧光光度计部件示意图,荧光仪部件,激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光，常用氙灯
4、、高压汞灯或激光光源. 样品池: 石英池, 四壁透明. 单色器: 两个光栅单色器, 分置于样品池前后. 检测器: 光电池或光电倍增管, 与激发光成直角的方向检测荧光.,荧光光度法的应用,生物化学分析，生理医学研究，临床检测. 直接测定能产生荧光的物质.带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸. 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质.荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧光络合物。 荧光熄灭法测定猝灭剂Ni2+对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（ 610-5 610-3 gmL-1）,N,OH,8羟基喹啉(Al,Be等),茜素紫酱R(Al,F-等),用于测定无机离子的有机试剂,黄酮醇(Zr,Sn等),举例 痕量3,4-苯并芘的测定:,萃取（环己酮或石油醚）浓缩层析 以H2SO4 溶解苯并芘荧光分析,荧光测定：ex = 520 nmem= 545 nm,测定方法标准曲线法,1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)； 2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(F), 根据工作曲线计算荧光物质的浓度.,
