1、核膜的研究,报告人：郭永龙,主要内容,1.核膜（nuclear membrane）的简介 2.核膜（nuclear membrane）的功能 3.科学前沿,核膜（nuclear membrane）简介,核被膜由内核膜（inner nuclear membrane）、外核膜（outer nuclear membrane）和核周隙（perinuclear space）三部分构成。核被膜上有核孔与细胞质相通。,外核膜胞质面附有核糖体，并与内质网相连，核周隙与内质网腔相通，可以说是内质网的一部分。外核膜上附着10nm的中间纤维intermediate filament，可见核是被内质网和中间纤维相对固
2、定的。 核周隙宽2040nm，腔内电子密度低，一般不含固定的结构。 内核膜的内表面有一层网络状纤维蛋白质，叫核纤层（nuclear lamina），可支持核膜,核被膜的结构组成,外核膜（outer nuclear membrane），胞质面附有核糖体，是特殊的内质网（ER） 内核膜（inner nuclear membrane），有特有的蛋白成分 核纤层（nuclear lamina），内核膜核质面的一层纤维蛋白 构成的网络状结构 核周间隙（perinuclear space），与内质网相通 核孔（nuclear pore），内外膜融合的部位组成, 构成核、质之间的天然选择性屏障避免生命活动的
3、彼此干扰，使生命活动更加井然有序保护DNA不受细胞骨架运动所产生的机械力的损伤 核质之间的物质交换与信息交流,核膜（nuclear membrane）的功能核膜的功能,核膜的崩解与装配,新核膜来自旧核膜 核被膜的去组装是非随机的，具有区域特异性 核被膜的解体与重建的动态变化受细胞周期调控因子的调节，调节作用可能与核纤层蛋白、核孔复合体蛋白的磷酸化与去磷酸化修饰有关。,核纤层的功能,1保持核的形态：是核被膜的支架，用高盐溶液、非离子去污剂和核酸酶去除大部分核物质，剩余的核纤层仍能维持核的轮廓。此外，核纤层与核骨架以及穿过核被膜的中间纤维相连，使胞质骨架和核骨架形成一连续网络结构。 2参与染色质和
4、核的组装：核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质（异染色质）在核周边锚定的位点。在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B型核纤肽与核膜残余小泡结合，A型溶于胞质中。在分裂末期，核纤肽去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。,核孔复合体（NPC）, 结构模型 核孔复合体成分的研究 核孔复合体的功能,结构模型,Nuclear basket,胞质环（cytoplasmic ring），外环核质环（nuclear ring），内环辐（spoke）柱状亚单位（column subunit）腔内亚单位（luminal subunit）环带亚单位（annular subuni
5、t）中央栓（central plug）：transporter,核孔复合体成分的研究,核孔复合体主要由多种蛋白质构成的一种复合结构 gp210：结构性跨膜蛋白 p62：功能性蛋白，具有两个功能结构域,gp210：结构性跨膜蛋白,介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，为核孔复合体装配提供一个起始位点在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用在核孔复合体的核质交换功能活动中起作用,p62：功能性的核孔复合体蛋白,疏水性N端区：在核孔复合体功能活动中直接 参与核质交换C端区：可能通过与其它核孔复合体蛋白相互作用，将p62分子稳定到核孔复合体上，为N端进行核质交换活动提供支持。,核孔复
6、合体的功能,核孔复合体是双功能（被动扩散和主动运输）、双向性（入核和出核）的亲水性核质交换通道。,被动运输（passive transport）主动运输（active transport）,被动运输（passive transport）,一般10nm的分子可以被动运输的方式自由出入核孔复合体，有的则由于含有信号序列或者和其它的分子结合成大分子而不能自由出入核孔复合体。,主动运输（active transport）,通过核孔复合体的主动运输主要是指亲核蛋白的入核，RNA分子及核糖核蛋白颗粒（RNP）出核运输。 选择性：对运输颗粒大小的限制；是信号识别和载体介导的过程；双向性：蛋白质的入核；RNA
7、和核糖体亚单位的出核。,亲核蛋白的入核,亲核蛋白的入核转运机制,亲核蛋白（karyophilic protein）是指在细胞质内合成之后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。 类型：进入核之后一直滞留在其中执行功能；穿梭于核质之间行驶功能。 1982年R. Laskey发现核内含量丰富的核质蛋白的C端有一个信号序列，可引导蛋白质进入细胞核，称为核定位信号（nuclear localization signal，NLS）。,。,亲核蛋白的转运步骤：结合（binding）（不需能量）转移（translocation）（需能量） 参与转运的因子：Ran(GTP结合蛋白)、Ran核苷交换因子等
8、,RNA的出核,转录的RNA需加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。RNA聚合酶I转录的rRNA分子：以RNP的形式离开细胞核； RNA聚合酶III转录的5s rRNA与tRNA的核输出由蛋白质介导； RNA 聚合酶II转录的hnRNA，在核内进行5端加帽和3端附加多聚A序列以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核，5端的m7GpppG“帽子”结构对mRNA的出核转运是必要的；, 细胞核中既有正调控信号保证mRNA的出核转运，也有负调控信号防止mRNA的前体被错误地运输，后者与剪接体有关。 mRNA的出核转运过程是有极性的，5 端-3 端。 核输出信号 (Nuclear Exp
9、ort Signal，NES)：RNA分子的出核转运需要蛋白分子的帮助，这些蛋白因子本身含有出核信号。,科学前沿,多个实验室通力合作绘制出首张核膜孔复合体样图,科学前沿,一个完美的小孔。研究人员十年研究终于绘制出一个由450个蛋白质组成的巨大复合体图，该复合体扮演着细胞核子看门人的角色。（图片来源：自然杂志）,科学前沿,据physorg网站2007年12月3日报道，与细胞膜绑在一起的核子中装有非常重要的脱氧核糖核酸，因此细胞必须非常谨慎地控制这一重要区域的物质进出。为了达到控制的目的，细胞使用了数百成个核膜孔作为进出这一空间的看门人，选择性膜通道负责调节和管理进出细胞脱氧核糖核酸的物质，同时还
10、控制着告诉细胞该做什么和如何做的信息。但是这些核膜孔的结构均非常大和灵活，因此使用现有技术方法不可能详细展现其结构。而目前，自然杂志上刊登了两篇具有里程碑意义的论文。美国洛克菲勒大学的科学家们首次完成了这一由450个蛋白质组成的巨大孔的分子级图，他们的研究发现使人类对核子的发展方式有了初步了解。这一核膜孔复合体结构是三个实验室九年通力合作的结晶。洛克菲勒大学的迈克尔.路特和布赖恩.查特与旧金山加州大学的安德烈.萨利是该项研究的主要参与者。路特负责生物化学方面的研究，而查特利用质谱技术确定和描述蛋白质和蛋白质复合体，萨利则负责设计出计算法则，对所有实验数据和数不胜数的结构进行运算，寻找最合适的一
11、个结构。通过与一个由博士后、学生和技术员组成的研究小组进行合作，该研究小组对大量数据收集和分析后，绘制出了一张核膜孔复合体草图。,科学前沿,计算机从约两万个不同的核孔成分蛋白质结构中进行挑选，发现了约一千个非常相似的结构，这些结构完全满足实验数据所提出的数千个限制条件：比如是哪些蛋白质和这些蛋白质在什么地方与这个核膜小孔连接起来。路特将此项研究描述为有点像一个纵横交错的拼字谜，慢慢地找到线索，然后把他们正确地拼接在一起。路特说他们的解决方案就是让每个蛋白质都找到他们各自的位置。科学家所取得的研究成果使他们有幸看到了真核状态下细胞的初期发展过程。细胞可以组成各种更高级的组织，从人类到植物及真菌类
12、都是如此。当这些细胞形成一个核和其它特定的细胞器官后，他们从母体分离，这使得他们形成各种不同的细胞代谢类型。路特说，细胞代谢类型的划分可能是由核膜和覆盖在其上面的复合体决定的，这些复合体就“像是一只小手”抓住、定型和固定膜。,科学前沿,路特和他的同事通过观察核膜孔后称，我们现在可以从这些初期结构中直接找到复杂的核膜孔。他说，“我们认为一旦细胞获得这一复合体后，他们就会带着它流动，开始复制这一复合体，并使其功能专门化”。在其它细胞膜中，这一复合体有多种明显不同的类型，比如内质网和高尔基型复合体，他们可能在各种细胞中扮演着相似的角色：抓住膜，对膜进行改造，并带着膜四处游荡。路特说，“细胞进化就是一
13、个复制和分裂的过程”。路特和他的同事对核孔中的蛋白质进行色码时观察到了有关这一过程的明显证据。一种色码方法发现了蛋白质交互斑纹，就像车轮上的轮辐：每一个蛋白质都有一个与其相当相似的蛋白质。另外一种色码方法在核膜孔内外环中发现了相同的蛋白质样式。路特说，这就是复制的证据。这表明复杂的核孔进化比以前所认为的更加简单易懂。他说，“许多种类型的蛋白质其它仅仅只是相同的一个。”,科学前沿,研究小组所绘制复合体结构图的每一段均与电子显微镜拍摄图像和其它方法所收集到的原始图像相符。然而，尽管这一结构图非常详细，但是它仍只是一幅草图。路特说，“这一幅图使我们能够初窥核孔是如何发挥作用的，但是我们希望进行更多的
14、研究。核孔是核子用来与细胞其它部分进行通讯的通信工具。假如你不了解这一点，你就不可能了解细胞工作的关键部分。假如你不了解这一点，你就不可能完整了解癌症是如何起作用的或单个细胞是如何发展成人的，或一颗小麦粒是如何发展成整个农作物的。你必须了解细胞这一机器，了解它的所有部件。”九年后，路特、查特和萨利已经非常接近于了解这一点。为帮助其它人了解这一点，他们帮助修建了由美国全国卫生研究所资助的动态相互作用研究国家中心，路特为中心主任，负责指导其它科学家了解这一过程。有了中心的支持，研究人员希望只花费一年，而不是十年来最终解释这一新分子之谜。,科学前沿,RC02961B小鼠抗核膜糖蛋白210抗体（gp2
15、10）ELISA试剂盒,科学前沿,ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,科学前沿,原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法（图a）、用于检测抗原的双抗体夹心法（图b）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。,
