1、 海藻糖 生物合成及应用 研究 进展 曲茂华 张凤英 何名芳 陈卫平 * （江西农业大学食品科学与工程学院 南昌 330045） 摘 要： 海藻糖是一种 非还原性二糖 ，是生物细胞抵抗不良环境 的应激代谢产物 ，它可广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。 本文对 最近几年 海藻糖 在 生物细胞中的合成途经及酶调控机制、海藻糖生产合成方法及生产菌种、海藻糖对生物细胞保护作用机理及海藻糖在相关领域中的应用等研究进展进行了综述。 关键词： 海藻糖 ， 酶 ， 合成 ， 调控机制 ， 应用 Research progress of trehalose biosynthesis and appli
2、cations QU Mao-hua ZHANG Fengying HE Mingfang CHEN Weiping * (Institute of food science and engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China) Abstract: Trehalose, a disaccharide with non-reducing as metabolite of cell in hostile environment, was used in domains of food, cosmetic,
3、 biological medicine and agricultural. The newest research progress of trehalose including synthesis pathways with enzyme regulatory mechanism, synthesis methods with producing strains, mechanism of protection for cell and applications in relative domains was reviewed in this paper. Key words: treha
4、lose; enzyme; synthesis; regulatory mechanism; application 中图分类号： TS245.9 文献标识码： A 文章编号 :2013120023作者简介：曲茂华（ 1989-），硕士研究生，研究方向为食品微生物。 *通讯作者 海藻糖是一种非还原性二糖， 分子式是C12H22O112H2O， 广泛分布 于 自然界中 许多生物 细胞中 。海藻糖 是一种生物应激代谢产物， 一些 在极端环境生长的古生 菌、真菌 ，以及一些生长在 不良 环境中 的动植物 细胞中海藻糖含量 较高。 甚至 在可以用于清理核污 染 的 抗 辐 射 型 细 菌 如 耐 辐
5、射 球 菌（ Deinococcus radiodurans ） 1中也发现了海藻糖的存在 。 海藻糖 在生物细胞中的 作用是保护细胞抵抗不良环境的影响 ， 其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分 子空间 结构和功能活性，维持 渗透压和 防止细胞内营养成分 流失。 由于 海藻糖 具 有 以上功能，它 可用于医学生物制品中起到保 护剂 的作用 2； 增强农 作物抗逆性 3， 通过转基因手段来 培育耐盐碱型农作物 4，培育抗冻果蔬等 ； 同时 ，海藻糖不具有还原性， 不会发生 美 拉德反应 ，可以 作 为 稳定的添加剂应用于食品工业 。 因此， 对海藻糖进行研究具有重要意义 ，本文针对海藻糖
6、 生物合成、 作用机理、 应用 方面的 最新 研究进展进行综述。 1 海藻糖合成 的相关 酶以及 调控途径 1.1 海藻糖合成途径 目前对 海藻糖合成 代谢途径的研究文献 较 丰富。 研究发现 在生物 体内 的海藻糖合成途径 主要有以下几 条 ：一是 OtsAB 途径，通过 TPS（ Trehalose-6-phosphate synthase，6- 磷 酸 海 藻 糖 合 成 酶 ） 和 TPP（ Trehalose-6-phosphate phosphatase， 6-磷酸海藻糖磷酸酯酶 ） 酶来形成海藻糖 5。 在酵网络出版时间：2014-02-20 16:01网络出版地址：http:/
7、 通过 TPS1 和 TPS2 酶来 合成 海藻糖 6，如酿酒酵母 ； 而其他一些真菌中的海藻糖合成途径还 有一些辅助性的 且作用不是很明显的酶 的参与， 如 TPS3 和 TSL17。二是 TreYZ 途径， 是 在 Arthrobacter sp.中发现的 ， 通过两步催化反应来合成海藻糖 8。三是 TreS（ Trehalose synthase， 海藻糖合酶 ）途径 ， 该途 径目前只在细菌中被 发现， TreS酶活具有可逆性 9，在谷氨酸棒状杆菌中，TreS 酶 在细胞内海藻糖过量情况下 会 将海藻糖转化为麦芽糖，以调节细胞内海藻糖浓度平衡 10。除以上几种途径外，还有两条 海藻糖
8、合成途径，分别为 TreT（ Trehalose glycosyltransferase， 海藻糖糖基转移酶 ） 途径和 TreP（ Trehalose phosphorylase， 海藻糖磷酸化酶 ） 途径，这两条途径与 TreS 途径一样，具有可逆的催化活性 11。 Mladen Tzvetkov 等人 12对 谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)进行研究，但研究重点在于弄清其中三条海藻糖合成途径的影响大小。研究表明， OtsAB 途径和 TreYZ 途径是细胞内合成海藻糖的两条主要途径，而 TreS 途径不是细胞内海藻糖的主要合成途径。通过 OtsAB
9、途径合成 1mol的海藻糖需要消耗 1mol 葡萄糖 -6-磷酸以及1mol 的 UDP-葡萄糖，但通过 TreYZ 途径合成 1mol 海藻糖需要消耗 2molADP-葡萄糖（用于糖原合成），并且细胞往往会优先选择 TreYZ 途径而不是 OtsAB 途径来合成海藻糖，而且在 C.glutamicum 培养基中添加微量的糖类碳源，细胞仅通过 TreYZ 途径就可以完全满足对海藻糖的需要。 1.2 海藻糖合成酶活性位点及调控途径 在分子水平对海藻糖合成酶进行研究的难度相对较高，目前 在此 方面研究进展较为缓慢，最大突破是 TreS 酶与 MTHase（ Maltooligosyltrehalo
10、se trehalohydrolase， 麦芽寡糖基海藻糖水解酶 ） 三维结构测定。 英国 与 日本科学家分别对 TreS 途径以及TreYZ 途径中的酶类进行详细研究，从分子角度成功阐述了相关代谢途径以及酶三维结构，并阐明其中的调控机制。 英国科学家 以具有产海藻糖能力的结核杆菌（ Mycobacterium tuberculosis） 13作为研究菌株，对细胞内 TreS 酶进行检测和分析，详细阐述了海藻糖合酶作用机制及其三维结构，发现 TreS 酶活可以整合到其它产物的合成途径中 14。 TreS 属于糖苷水解酶家族（ Family GH13） 15，其结构由两段保守区域组成，一个是催化
11、区域（ (/)8 barrel-like 折叠，也称 TIM barrel 折叠），另一个是 C-末端 -夹心结构区域。其中靠近酶活性位点的 3-4 环状结构是钙离子结合位点，但是其 功能尚不明确。 7-8 环状结构主要作用是在底物催化过程中固定底物，使底物在整个催化过程中一直固定于酶活性位点上。在催化麦芽糖时，催化反应一直在酶的活性位点上进行，其间所形成的葡萄糖单体不会释放，直到葡萄糖单体重新合成出海藻糖为止。另外，产物也是通过7-8 环状结构固定于酶活性位点上，当产物需要释放时， 7-8 环状结构中所含的两个保守区域中的氨基酸发生替换（ Ser（丝氨酸） 替换了 Thr（苏氨酸） ； As
12、p（天冬氨酸） 替换了 Ser），使得环状结构发生重构而失去固定作用，将产物释放到溶液中并接纳新的底物。 MTHase 是海藻糖合成途径中一种重要的 a- 淀 粉 酶 16 。 该 酶 与 MTSase（ Maltooligosyltrehalose synthase， 麦芽寡糖基海藻糖合成酶 ） 协同作用，切割中间产物化合物中的 -1,4 糖苷键生成 海藻糖， 该过程对海藻糖的形成起着至关重要的作用。 研究发现 17， Asp252（天冬氨酸） 与 Glu283（谷氨酸） 位于 MTHase 的催化位点处，在实验中构建突变株： D252S(Ser 替换了Asp252) 、 D252E（ Se
13、r 替换了 Glu283）、E283Q（ Gln（谷氨酰胺） 替换了 Glu283） ，同野生型菌株比较，它们的酶活性 仅为对照组野生菌株 酶活性 的 0.04% ， 0.03% 和 0.6%。 对突变株与野生型菌株所产生的MTHase 进行结构分析以及底物催化试验，结果表明， 使用 Ser 或 Thr 替换 Asp252 后，在反应时在活性位点酶与底物之间会插入一个水分子，这样会使原先的双取代机制变为单一取代机制，对 Glu252 进行替换后，反应中会形成稳定的酶 -底物复合物。Asp252 与底物所发生的双取代反应有直接关系， Glu 则控制底物或产物的释放。 2海藻糖生 产应用 研究 2
14、.1海藻糖 生产方法 海藻糖生产目的是为了获得 高纯度海藻糖产品以及相关酶产品 18。 由于海 藻糖普遍存在 于 生物细胞中，微生物细胞中含量更为丰富 ， 目前在试验室和生产上制备 海 藻糖主要有三种方法：一是从生物细胞中提取 ；二是采用微生物发酵生产 ； 三是采用微生物发 酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。 发酵法 ：由于微生物生长旺、繁殖快，易于培养，采用深层发酵海藻糖具有先天的优越性，利用 产海藻糖 酵母、细菌等为出发菌株 ， 选育出 产海藻糖 高产菌株， 发酵 生 产海藻糖，再采用有效分离提取 的方法提取和精 制。 酶合成 法： 酶合成法是 采用 微生物发酵产生 并提取相关海
15、藻糖合成酶类 ，以 各 类碳水化合物为 底物来合成海藻糖 。 酶的最大缺点是其脆弱性，容易失活，实际生产中使用相关合成酶进行海藻糖生产， 要考虑 保持酶活性 和酶类制剂的成本 ，可 使用酶固定化或细胞固定化技术来保护酶类 。目前 ， 海藻糖酶的固定化这方面研究 比较少。 2.2海藻糖相关菌株筛选与改良 无论采用发酵法或酶法生产海藻糖， 获得优良菌株对海藻糖工业化生产具有重要价值 ， 如能采用基因工程等技术获得可 在 胞外积累 的菌株 生产 海藻糖 ，对于 提高 生产 效率 有 较大 意义。 海藻糖合成方面可以使用的菌株非常广泛，包括酵母、根霉、细菌以及一些藻类都可以生产海藻糖。 在酵 母菌方面
16、，一般使用的菌株为酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）以及耐寒性酵母（ Guehomyces pullulans）等，它们都可以在细胞内通过 TPS1与 TPS2酶催化生产海藻糖 19， 直接 用抽提法从酵母菌中获取海藻糖，但是这种方法效率偏低。 Franois J M等 20 重 点 研 究 探 讨 了 Saccharomyces cerevisiae中与海藻糖合成有关基因调控机制，对酵母细胞内海藻糖提取工艺进行一定程度优化。 除了用酵 母 外，海藻糖生产菌株主要集中于杆菌属和球菌属等菌株 21。如谷
17、氨酸棒状杆菌（ Corynebacterium glutamicum）、结核杆菌（ Mycobacterium tuberculosis）、恶臭假单孢菌（ Pseudomonas putida）、浑浊红球菌（ Rhodococcus opacus）、丙酸杆菌（ Propionibacterium freudenreichii）及耐辐射球菌（ Deinococcus radiodurans ）等菌株，都可以用于生产海藻糖 22。大肠杆菌在渗透压胁迫环境中也可以 积累内源性海藻糖，大肠杆菌虽然可以生产海藻糖，但需要通过基因改良除去细胞中的海藻糖酶才能应用于工业生产，并且需要进一步考察在海藻糖过量情
18、况下海藻糖对大肠杆菌细胞的不利影响，这也是使用大肠杆菌来生产海藻糖的研究重点 23 。 Mary Jackson 等研究了Mycobacterium tuberculosis中海藻糖合成代谢机制 24，并对相关基因调控进行总结，得到有效生产海藻糖的改良型突变株。结核杆菌虽能有效地在细胞内积累海藻糖，但结核杆菌属于致病菌，不建议用于海藻糖工业化生产。 嗜热菌株中 可用于 海藻糖生产 的 菌 株有 嗜热栖热菌（ Thermus thermophilus）、红色亚栖热菌（ Meiothermus ruber）、高温单胞菌（ Thermomonospora curvata）、及一些极端嗜热的古生菌如耐
19、超高温热棒菌（ Pyrobaculum aerophilum）、硫矿硫化叶菌（ Sulfolobus solfataricus ） 与 热 球 菌（ Pyrococcus horikoshii ）等 25都可以在高温环境中积累海藻糖，并在菌种改良后投入工业化生产，但要考虑发酵环境以及相关设备耐热性 、及能耗等因素 。 嗜热菌株中海藻糖合成途径普遍只有海藻糖合酶途径。由于海藻糖合酶活性可逆，因此海藻糖产量不很稳定。在嗜热菌筛选过程中，取样点最好选在温度 极 高（最好在 45 以上）的地方，如活火山口，工厂废热水排放口等常年高温的环境。 另外， 嗜极菌如嗜酸菌 （ Picrophilus torr
20、idus） 26等 也可生产海藻糖 。 采用 基因测序方法来筛选海藻糖合成菌株并通过转基因或基因敲除等手段改良现有生产菌株 27， 可 使得海藻糖产量有较大幅度提高。目前在新菌株找寻以及现有生产菌株改良方面，使用基因工程手段对菌株进行直接操作的人工定向基因突变技术 ， 正代替以往使用的紫外诱变等非定向基因突变育种技术。 而 紫外诱变以及化学试剂诱变仍是有效的菌种改良手段 28，如在谷氨酸棒状杆菌诱变育种中，选择 IPTG(异丙基硫代半乳糖苷 )作为诱变剂，可以有效地培育出海藻糖高产突变株，而 NTG(亚硝基胍 )对谷氨酸棒状杆菌几乎没有诱导作用 29。但是紫外诱变和化学诱变方法弊端比较大，比如
21、正突变相对过少，筛选过程繁琐等 。 3 海藻糖对生物细胞保护作用机理 目前，海藻糖对 生物 细胞保护作用机理的研究已经取得较大进展，相关研究主要集中在细胞处于各种不利环境（如寒冷、干旱、高离子浓度等）中 时，海藻糖对细胞的保护机理 30。当细胞处于寒冷环境中时，含有海藻糖的细胞其耐冻性要高，这是由于 海藻糖的存在提高了细胞中溶质浓度，有效降低细胞质的冰点。 在缺水状态下，细胞中会积累大量的海藻糖，这些海藻糖可以在细胞脱水状态下与脂类物质形成化合物（ Trehalose dinocardiomycolates）来维持生物膜结构 31，阻止细胞内囊泡 溶解，并且降低脂类物质发生变质， 保持脂类物质
22、的正常状态和功能32。 海藻糖应对干燥环境的机制是形成玻璃化结构 33。海藻糖会形成一种类似 于玻璃态的结构， 这种结构表面形成 海藻糖二水化合物，将水分子牢牢的固定在细胞内，从而阻止水分的流失，维持细胞的整体结构。有研究表明，盐分胁迫对生物细胞有两方面的影响 34，一是造成渗透压差，使细胞内水分流失；二是在细胞周围制造一个高离子强度的环境。细胞自身的适应性调节是在细胞质中积累大量可溶性溶质 35，这些溶质对于缓解细胞所遭受的盐分胁迫具有两方面的抵御作用 36，一是降低细胞内外浓度差，二是稳定细胞内蛋白质结构与功能。 Andreas Wolf 等人 37对谷氨酸棒状杆菌（ Corynebact
23、erium glutamicum）中海藻糖作用 机制以及酶调控机制进行深入研究与探讨，通过对这些突变株的环境耐受性进行测定与分析，海藻糖可以通过与细胞中的脂质形成化合物来 保护 生物膜，维持谷氨酸棒状杆菌细胞的稳定性。 4 海藻糖的应用 4.1 在 食品工业中的应用 海藻糖在食品工业中 的应用主要体现在 两 方面： 4.1.1 作为保护性添加剂使用 由于 海藻糖在 氢 离子较高的 条件下能保持相对 稳定状态 38，在含氨基酸或 蛋白质的沸水 中不 会 发生美拉德反应 特性 ， 可以使 食品 中营养性风味物质 保存完好 39， 有效延长 食品相关 产品货架期 。 将海藻糖添加进淀粉类食品中，可以
24、有效防止在常温和 低温下淀粉类食品老化现象 40，改善食品品质。另外，海藻糖处于无定形 状 态时极易吸收水分，可以作为 食品优良的安全干燥剂 41。 4.1.2 作为 食用性糖类开发新型食品 将海藻糖作为一种高级食用糖来进行工业化生产 42，需要考虑相关成本问题。与几十年前初期相比，目前海藻糖工业化产量有较大幅度提升，但如果用作食用糖，其成本依然比普通糖类如蔗糖等要高，并且涉及到菌株改良以及提取工艺等一系列问题，大规模用作食用糖还需很长的路要走。目前，海藻糖的食用性仅仅体现在食品添加剂层面 43。 4.2 医学领域中的应用 海藻糖 在生物医学领域中也有广泛应用。生物制剂对环境的敏感性很高，生物
25、医学领域中涉及到的材料多属于容易失活的生物制剂，如何提高生物制剂对于环境的抗逆性 44，降低保存成本并延长保存期，是该领域要研究的关键问题。相关研究结果表明，通过添加海藻糖或转基因手段将海藻糖相关酶类的调控基因片段导入到细胞内，增强相关生物制剂的环境抗逆性 45，并具有显著效果。 Nan Zhang46等利用转基因技术将藻类中与海藻糖合成有关的基因片段导入到酵母细胞中，研究酵母在高盐浓度下的细胞存活率与海藻糖的生产率之间的关系，与对照组相比，导入 海藻糖相关合成基因的细胞能够在极高渗透压环境中生存，而且环境中盐浓度越高，细胞内海藻糖的浓度也相应越高直到达到最大值。 4.3 农业方面的应用 海藻
26、糖对于果蔬植物环境抗逆性的提高也有重要意义。 Jin Duan 等 47通过实验将假单孢菌（ Pseudomonas sp.）海藻糖合成酶相关基因片段导入植物细胞，与对照组相比，在寒冷，重金属存在、干燥等各种极端环境中， 细胞内 积累海藻糖 的植物抗逆性有明显改善。 此外 ， 根据 Theerakulpisut 的最新研究显示 48，使用 海藻糖 溶液处理后的水稻种子，可以在高盐浓度环境 中生长， 能 有效减 轻 NaCl 对细胞中叶绿素的损害， 同时降低 细胞内 Na+与 K+含量 的比 值，促进水稻发芽和生长。 将调控海藻糖合成相关基因导入到其他物种中，培育出抗逆性强的改良物种 49。这方
27、面研究应用性非常强，主要用于培育抗旱抗寒以及抗盐碱型农作物 50，使得植物可以适应更加恶劣的环境。 5 结论 海藻糖 是生物细胞抵抗不良环境 的应激代谢产物， 海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境 影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分维持空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分的流失。 相关研究表明： 海藻糖在生物体内的合成，主要有 OtsAB 途径 、 TreYZ 途径 、 TreS途径 、 TreT 途径和 TreP 途径， 后三 条途径具有可逆的催化活性。 对海藻糖代谢调控机制还不完全清楚，仅停留在对海藻糖合酶（ TreS ） 与 麦 芽寡 糖基 海藻
28、糖水 解 酶(MTHase)三维结构研究。同时，很多研究成果仅局限在初步明确了几条海藻糖合成途径，对海藻糖合成途径中相关酶类研究仍然不足。 目前在 实 验室 和生产上制备 海 藻糖主要有三种方法：一是从生物细胞中提取；二是采用微生物发酵生产；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。 目前快 速发展的生物技术促进 了 对海藻糖的研究。 更 需要对海藻糖相关生产菌株进行深入研究，重点在于培育出产量较高的生产菌株以及开发出相关生产工艺。对相关酶类代谢机制以及酶三维结构分析的研究是目前该领域研究热点，随着现代分子生物技术大幅度进步以及更先进分析仪器和相关配套软件的出现与应用，形成了
29、软硬件相互结合并行研究的新局面，在 海藻糖 基础领域研究一定能取得新的进展。 海藻糖应对干燥环境的机制是形成玻璃化 结构，阻止水分流失，维持细胞整体结构。在高渗环境中，海藻糖 可以有效 降低细胞内外浓度差，稳定细胞内蛋白质结构与功能。 由 于 海藻 糖是一种 非还原性二糖， 不会发生美拉德反应， 能 保护生物细胞和抵抗不良环境，因此，被广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。 参考文献 1 Daly M J. A new perspective on radiation resistance based on Deinococcus radioduransJ. Nature Reviews
30、 Microbiology, 2009, 7(3): 237-245. 2 Hui Li, Hui-Ling Wang, Jun Du, et al. Trehalose protects wine yeast against oxidation under thermalJ. World J Microbiol Biotechnol, 2010, 26(6):969-976. 3Zhang S Z, Yang B P, Feng C L, et al. Expression of the Grifola frondosa Trehalose Synthase Gene and Improve
31、ment of Drought Tolerance in Sugarcane (Saccharum officinarum L.)J. Journal of Integrative Plant Biology, 2006, 48(4): 453-459. 4 Krasensky J, Jonak C. Drought, salt and temperature stress-induced metabolic rearrangements and regulatory networksJ. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(4): 1593-16
32、08. 5 Lies Vandesteene, Matthew Ramon, Katrien Le Roy, et al. A Single Active Trehalose-6-P Synthase (TPS) and a Family of Putative Regulatory TPS-Like Proteins in ArabidopsisJ. Mol Plant, 2010, 3(2):406-419. 6 Zhang F, Wang Z P, Chi Z, et al. The changes in Tps1 activity, trehalose content and expr
33、ession of gene in the psychrotolerant yeast 17-1 grown at different temperaturesJ. Extremophiles, 2013, 17(2): 241-249. 7 Avonce N, Mendoza-Vargas A, Morett E, et al. Insights on the evolution of trehalose biosynthesisJ. BMC evolutionary biology, 2006, 6(1): 109. 8Flechard M, Fontenelle C, Blanco C,
34、 et al. RpoE2 of Sinorhizobium meliloti is necessary for trehalose synthesis and growth in hyperosmotic mediaJ. Microbiology, 2010, 156(6): 1708-1718. 9 Kian Mau Goh, Charles Voon, Yen Yen Chai,et al. Illias. Meiothermus sp. SK3-2: A potential source for the production of trehalose from maltoseJ. Af
35、rican Journal of Biotechnology, 2011, 59(10):12745-12753. 10 Kim T K, Jang J H, Cho H Y, et al. Gene cloning and characterization of a trehalose synthase from Corynebacterium glutamicum ATCC13032J. Food Science and Biotechnology, 2010, 19(2): 565-569. 11 Paul MJ, Primavesi LF, Jhurreea D, et al. Tre
36、halose metabolism and signalingJ. Annual Review of Plant Biology， 2008， 59(1）： 417-441. 12 Tzvetkov M, Klopprogge C, Zelder O, et al. Genetic dissection of trehalose biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: inactivation of trehalose production leads to impaired growth and an altered cell wall lip
37、id compositionJ. Microbiology, 2003, 149(7): 1659-1673. 13 Jackson M, McNeil M R, Brennan P J. Progress in targeting cell envelope biogenesis in Mycobacterium tuberculosisJ. Future Microbiology, 2013, 8(7): 855-875. 14 Roy R, Usha V, Kermani A, et al. Synthesis of -Glucan in Mycobacteria Involves a
38、Hetero-octameric Complex of Trehalose Synthase TreS and Maltokinase Pep2J. ACS Chemical Biology, 2013（ 8）： 22452255. 15 Henrissat B, Callebaut I, Fabrega S, et al. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolasesJ. Proceedings of the Natio
39、nal Academy of Sciences, 1995, 92(15): 7090-7094. 16 Fu C, Wang Y P, Fang T Y, et al. Interaction between Trehalose and MTHase from Sulfolobus solfataricus Studied by Theoretical Computation and Site-Directed MutagenesisJ. PLOS ONE, 2013, 8(7): e68565-e68574. 17Okazaki N, Tamada T, Feese M D, et al.
40、 Substrate recognition mechanism of a glycosyltrehalose trehalohydrolase from Sulfolobus solfataricus KM1J. Protein Science, 2012, 21(4): 539-552. 18 Woodruff P J, Frederick T M. Bacteria with increased trehalose production and method for using the same in bioremediation: U.S. Patent 8,481,026P. 201
41、3-7-9. 19Mahmud S A, Hirasawa T, Shimizu H. Differential importance of trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae in response to various environmental stressesJ. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 109(3): 262-266. 20 Franois J M, Walther T, Parrou J L. Genetics and Regulation of
42、 Glycogen and Trehalose Metabolism in Saccharomyces cerevisiaeM/Microbial Stress Tolerance for Biofuels. Springer Berlin Heidelberg, 2012: 29-55. 21 Ali S Z, Vardharajula S. Isolation and identification of a thermotolerant plant growth promoting Pseudomonas putida producing trehalose synthaseJ. Jour
43、nal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 2013, 3(1): 63-68. 22 Dalmasso M, Aubert J, Even S, et al. Accumulation of intracellular glycogen and trehalose by Propionibacterium freudenreichii under conditions mimicking cheese ripening in the coldJ. Applied and Environmental Microbiology, 2
44、012, 78(17): 6357-6364. 23Sugawara M, Cytryn E J, Sadowsky M J. Functional role of Bradyrhizobium japonicum trehalose biosynthesis and metabolism genes during physiological stress and nodulationJ. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(4): 1071-1081. 24 Jackson M, McNeil M R, Brennan P J.
45、Progress in targeting cell envelope biogenesis in Mycobacterium tuberculosisJ. Future Microbiology, 2013, 8(7): 855-875. 25Kian Mau Goh, Charles Voon, Yen Yen Chai, et al. Illias. Meiothermus sp. SK3-2: A potential source for the production of trehalose from maltoseJ. African Journal of Biotechnolog
46、y, 2011, 10(59):12745-12753. 26Hsin-Hung Choud,Shu-Wei Chang, Guan-Chiun Lee, et al. Site-directed mutagenesis improves the thermostability of a recombinant Picrophilus torridus trehalose synthase and efficiency for the production of trehalose from sweet potato starchJ. Food Chemistry, 2010, 119(3):
47、1017-1022. 27 Yan J, Qiao Y, Hu J, et al. Cloning, Expression and Characterization of a Trehalose Synthase Gene From Rhodococcus opacusJ. The Protein Journal, 2013: 1-7. 28Goddijn O J M, Pen J, Smeekens J C M. Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate: U.S. Patent Applica
48、tion 13/361,046P. 2012-1-30. 29Padilla L, Krmer R, Stephanopoulos G, et al. Overproduction of trehalose: heterologous expression of Escherichia coli trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase in Corynebacterium glutamicumJ. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(1): 370-376. 30 Nishant Kumar Jain, Ipsita Roy. Effect of trehalose on protein structureJ. Protein Science, 2009, 18(1): 24-36. 31 Panek A, Pietrow O, Filipkowski P, et al. Effects of the polyhistidine tag on kinetics and other properties of trehalose synthase from Deinoco
