1、第29卷第3期 2009年6月 林 产 化 学 与 工 业 Chemistry and Industry of Forest Products Vo129 No3 June 2009 千层塔中石杉碱甲提取分离工艺研究 李玉山 (四川农业大学信息与工程技术学院，四川雅安625014) 摘要： 利用单因素法和正交试验设计，确定了从千层塔中提取石杉碱甲的最佳工艺条件为：乙 醇体积分数80，料液比1：25(g：mE)，提取时间3 h，提取温度60 oC；最佳分离条件为：DIO1树脂 吸附，80乙醇室温下洗脱，总收率03，纯度可达l0。 关键词：千层塔；石杉碱甲；吸附；萃取 中图分类号：TQ3510 文
2、献标识码：A 文章编号：025324t7(2009)03010304 Extraction and Separation of Huperzine A from Huperzia serrata(Thunb)Trev LI Yushan (School of Information and Engineering Technology，Sichuan Agricultural University，Ya aft 625014，China) Abstract：The optimum technological conditions of extracting hupein A from Hupe
3、rzia serrata(Thunb)Treyby single factor test and onhogonal design method were studiedThe optimum extraction conditions were as follows：ratio of ethanol to sample 25：1 (mL：g)，extraction time 3 h，extraction temperature 60The optimum purification conditions were as follows：ethanol volume fraction 80。D1
4、01 macroporous adsorption resin eluted under room temperature，to obtain an overall yield of 03and a purity of 10 Key words：Huperzia serrata(Thunb)Trey；huperzine A；adsorption；extract 千层塔(Huperzia serrata(Thunb)Trey)又名蛇足石杉，蛇足草、金不换，是一种珍贵的药用植物。 主要分布于东北，长江流域及华南、西南各地，亚洲其他地区，大洋洲、中美洲的古巴，墨西哥等地也有分 布一 。自1972年国
5、内首次报道该植物的生物碱在动物实验上有横纹肌松驰作用后 ，1981年分离了 石杉碱甲等多种生物碱 j。千层塔中生物碱主要有石杉碱甲、石杉碱乙、石杉碱丙、石松灵碱、石松宁 碱、山芝宁碱、山芝亭碱、石松定碱、蛇足石杉碱、三萜类有山芝烯二醇、3一乙酸三芝烯二醇、2l一表山芝 烯二醇、山芝三醇 ，是一种可逆性乙酰胆碱酯酶的抑制剂 ，对重症肌无力，记忆力减退和老年性痴 呆有良好疗效 j，是治疗阿耳茨海默症的一个有前景的药物 j。1993年美国食品药物管理局(FDA) 批准石杉碱甲片属类胆碱能剂，现已被国际上列为第二代乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂之一 。随着 老龄化社会的到来，老年痴呆和记忆障碍成为临床
6、迫切需要解决的问题 J，石杉碱甲对任何想提高记 忆和认识功能，思维敏捷的人都是有必要的u 。因此作为新型AChE抑制剂自1985问世以来，由于其 有治疗时间长、治疗指数高的特点，有广泛的临床适用性，应用前景十分广阔，但随着蛇足石科植物资源 日益缺乏，国际市场上石杉碱甲价格猛升，寻找新的石杉碱甲资源具有重要意义_ 。 l材料与方法 11材料及仪器 千层塔购自广西桂林，经西安惠丰生化公司刘涛总工程师鉴定为蕨类植物干层塔的全草，石杉碱甲 对照品购自Sigma公司。乙醇(95)、石油醚(60-90 cc)、盐酸、氨水、氯仿均为分析纯。5 cm x20 cm 收稿日期：20080328 作者简介：李玉山
7、(1974一)，男，陕西西安人，工程师，从事天然产物提取分离与合成；Email：liyushan0508sinacom。 林产化学与工业 第29卷 薄层层析硅胶板，D101大孔吸附树脂。美国Waters高效液相色谱仪、R一201旋转蒸发器、2X一1型旋片 式真空泵 12实验方法 121 石杉碱甲提取石杉碱甲粗提物工艺流程如下： 千层塔粗粉 厂_+滤渣 一一I= 堑r_ 垫鲨卜 滤液 122 石杉碱甲含量测定 高效液相色谱法测定石杉碱甲含量。色谱条件：色谱柱Altrima C18柱 (46 IIlIl150 nm)；流动相为甲醇一01 molL乙酸铵缓冲液(pH值60)(体积比36：64)；流速
8、 06 mlrain；检测波长308 nm；柱温为室温。 对照品液的配制：取石杉碱甲对照品适量，加流动相制成0005 gL的对照品溶液。样品液的制 备：取千层塔提取物适量(相当于石杉碱甲0125 mg)，置于25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻 度，摇匀，作为样品溶液。测定：分别取对照品及样品液各2 mL，进样分析。 123石杉碱甲提取的单因素试验分别考察不同料液比、提取温度、提取时间、提取次数和不同乙醇 体积分数对石杉碱甲得率的影响。提取液过滤、定容后测石杉碱甲含量和得率。 124石杉碱甲提取工艺的优化以石杉碱甲得率为考察指标，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度 和提取时日】4个因素，采
9、用L。(3 )正交设计，研究最佳提取工艺参数。 125石杉碱甲分离方法采用两种方法分离：液一液萃取法和大孔吸附树脂吸附法，工艺过程如下： 液一液萃取法流程：滤液经酸化后过滤，过滤后的滤液经碱化萃取，有机相浓缩，烘干，粉碎，包装。大孔 吸附树脂吸附法工艺流程：提取液经D101树脂吸附，洗脱，洗脱液浓缩干燥，粉碎，包装。 126 石杉碱甲分离的单因素试验萃取法分别考虑萃取时酸度、碱度、萃取次数对富集石杉碱甲的 影响；大孔树脂吸附法主要考虑不同体积分数乙醇洗脱下石杉碱甲的得率。 2结果与讨论 21 石杉碱甲提取的单因素试验 211 乙醇体积分数的影响精确称取千层塔100 g，各6份，在提取温度7O
10、c二、提取时间2 h的条件下， 分别以不同体积分数的乙醇提取，提取液过滤、定容，测定石杉碱甲含量，计算石杉碱甲得率，结果见图1 (a)。可见体积分数80乙醇提取效果最好，其次为90和70，选这3个水平进行正交试验。 212料液比的影响精确称取千层塔100 g各5份，提取液为80乙醇，其他条件相同，考察不同 料液比的影响，结果见图1(b)。可见料液比1：25提取效果最好，其次为1：30、1：20，选这3个水平进 行正交试验。 213提取温度的影响精确称取千层塔100 g各5份，各加入料液比1：25的8O乙醇提取，其他 条件相同考察不同温度的影响，结果见图1(e)。可见60提取效果最好，其次为7O
11、和5O，选取 50、60、7O cI=进行正交试验。 214提取时间的影响 精确称取千层塔100 g，各5份，以料液比为1：25加入80乙醇在60下 提取，其他条件相同，分别提取1、2、3、4和5 h，结果见图l(d)。可见提取2 h时提取效果最佳，选取 1、2和3 h进行正交试验。 215 不同提取次数的影响经试验提取次数对石杉碱甲得率的影响不大，正交设计试验中忽略此因 素，提取次数定为1次。 根据单因素试验结果得出乙醇最适体积分数80、料液比1：25、提取温度60、提取时间2 h。 22石杉碱甲提取条件的优化结果及分析 任单因素试验的基础上选取乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间，按L
12、 (3 )正交表进行条 第3期 李玉山：千层塔中石杉碱甲提取分离工艺研究 件优化 B ，结果见表1。 O 0 褂0 O O O O 薅0 O 0 50 6o 70 80 90 l00 l：10 l：l5 l：20 l：25 l：30 乙醇体积分数肠 料液比 O O 0 2窭 0 O 提取温度， 提取时间1 图1乙醇体积分数(a)、料液比(b)、提取温度(C)及提取时间(d)对石杉碱甲得率影响 Fig1 Effects of ethanol volume fraction(a)，solid：liquid ratio(b)，extraction temp(c)and extraction time
13、d)on huperzine A yield 表1 L (3 )试验方案及试验结果 Table 1 L9(3 )experimental scheme and results 根据极差( )的大小，可知其影响顺序为ACBD，直观分析可知最佳工艺为A B C D ，即乙 醇体积分数为80，料液比为1：25，提取时间3 h，提取温度60 cc。 随乙醇体积分数的升高，由于石杉碱甲是醇溶性的，不溶于水，故其提取率增大，但含量有所下降， 石杉碱甲的得率是提取率与含量相互影响的结果。故8O的乙醇为最佳醇度；料液比太小时，有效成 分不能充分溶出，料液比太大，则提取液中杂质也相应溶出较多，其合理的料液比为1
14、：25；由于石杉碱 甲含内酯结构不稳定，因此提取时间过长会遭到破坏，同时由于其为热敏性物质，故提取温度不宜过高。 23石杉碱甲液一液萃取分离法各单因素试验 231 酸度影响取滤液100 mL各5份，分别调pH值为1、2、3、4、5，其他条件相同，有机溶剂萃取 相浓缩干燥，称质量，按含量测定法计算石杉碱甲含量。以干物质中石杉碱甲的量与酸液的pH值关系 作图，结果见图2(a)。由图可知在pH值为3时，石杉碱甲富集效果最佳，较强酸度时遭破坏，石杉碱 甲分子中含有吡啶酮内酰胺氢和氨基氢，两者对pH值敏感。 232碱度的影响取过滤后的酸液100 mL各6份，分别以1：1 NH H2O调pH值6、7、8、
15、9、10和 11，有机溶剂萃取后，浓缩有机相，干燥，称质量，按含量测定法计算含量。求出干物质中石杉碱甲的量， 以干物质的量与pH值的关系作图，结果见图2(b)。由图可知pH值9时，富集效果最好，较强碱时，石 杉碱甲内酰胺遭破坏，较弱碱性下石杉碱甲由离子状态未完全转化为游离状态，此两者下都不利于石杉 碱甲富集。 233萃取次数的影响取pH值9的碱液100 mL各6份，分别以等体积有机溶剂萃取1、2、3、4、5 和6次，有机相浓缩、干燥、称质量，计算石杉碱甲含量，求出干物质中石杉碱甲的量。以干物质的量与 lO6 林产化学与工业 第29卷 萃取次数作图，结果见图2(c)。由图可知，曲线呈抛物线形，萃
16、取次数越多效果越好，在萃取次数达6 次时，基本呈饱和，考虑到成本因素，以萃取5次较为合适。 l 董1 窭t 1 2 3 4 pH值 l 罂 溪 5 6 7 8 9 10 1l pH值 吕 衄】 撂 1 2 3 4 5 6 萃取次数 图2酸度(a)、碱度(b)以及萃取次数(c)对石杉碱甲得率影响 Fig2 Effects of pH value(a)，alkalinity(b)and extraction times(c)Oil huperzine A yield 24石杉碱甲大孔树脂吸附实验结果 取5份等量的pH值6的提取液，在5根相同规格的大孔吸附树脂柱中吸附，吸附饱和后，分别先以 等量的纯
17、化水水洗，接着再分别以等量50、60、70、80和90乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，得 到5份洗脱液，浓缩、干燥，称质量，计算含量，结果分别为86、98、115、134和135 mg。可见用 80乙醇洗脱已能将有效成分基本完全洗脱下来，90的乙醇洗脱，虽收率效高，但其杂质的量也多， 实际上千物质中石杉碱甲的含量下降。考虑后工序的纯化，为减少杂质，以80乙醇洗脱最佳。 3 结论 31 通过研究以广西桂林的千层塔为原料提取分离石杉碱甲的两种工艺，得到最佳提取工艺为：乙醇 体积分数为80，料液比为1：25(g：mL)，提取时间3 h，提取温度60，提取次数1次。两种分离方法 各有优缺点，萃取法工艺复杂，
18、收率不高，含量也低，成本也高。而树脂吸附法收率高，含量高，成本低， 但树脂再生困难，故建议用大孔树脂吸附法。 32采用本工艺提取分离石杉碱甲，含量达到510，千层塔中还含有其他一些成分，如石杉碱 乙、石杉碱丙等，采用大孔树脂吸附法富集石杉碱甲具有工艺流程简单，无环境污染、操作简便、成本较 低等特点，已在工业化生产中得到了应用。 参考文献 1侯团章巾草药提取物M北京：中国医药科技出版社，2004：269 2鲁润龙，周忠泽，鲍时来，等药用植物蛇足石杉的生物学特性J中国科技大学学报，1999，29(1)：l18121 3袁珊琴，冯锐，顾国明蛇足石杉生物碱成分的研究J中草药，1995，26(3)：11
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