1、纳米级水溶性壳聚糖配合物的合成及其与 DNA 相互作用的机理研究汪庆祥，谢江坤，袁显龙，焦奎（青岛科技大学化学与分子工程学院，青岛 266042）摘要 将壳聚糖用双氧水氧化降解成纳米级水溶性的壳聚糖，表征了其脱乙酰度和平均分子量。合成了含铜低聚壳聚糖配合物(CHTCu)。采用粘度法和电化学法研究了 CHTCu 与 DNA 的相互作用。粘度法实验表明配合物的加入能使得DNA 的相对粘度增大。电化学实验表明在 0.01 mol/L pH=7.0 的 Tris-HCl 缓冲溶液中，CHTCu 在-0.04 V 处和-0.36 V 处有一对不可逆氧化还原峰。当加入一定量的 DNA 后，配合物峰电位出现
2、正移和峰电流明显降低，验证了二者之间的嵌插作用模式。在最佳条件下，峰电流的降低值与 DNA 的浓度在0.0010.125 g/L 范围内呈良好的线性关系。关键词 水溶性壳聚糖；DNA；铜配合物壳聚糖分子中的-OH 和-NH 2 基对金属离子有一定的配位作用，是一种天然螯合剂 1。人们利用这一性质来分离某些金属离子，处理含重金属离子工业废水等 2。壳聚糖及其改性衍生物的金属离子配位化合物研究在诸多领域都有其应用前景。稀土元素和贵金属元素的壳聚糖配合物具有良好的催化活性 3。过渡金属元素的壳聚糖配合物除具有催化活性外，有些具有抗菌活性和抗癌活性 4，在生物学和医学上具有潜在的应用价值。壳聚糖作为一
3、种基因载体能通过与DNA 以静电方式作用使壳聚糖-DNA 体系不被降解，完全进入细胞，具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点，引起了大家的重视。本文首先对壳聚糖进行氧化降解得到水溶性好的低分子量壳聚糖(CHT)，以 CHT 作为配体了合成 Cu(II)配合物并进行了表征，然后采用粘度法、光谱法和电化学方法研究壳聚糖铜配合物与 DNA 的相互作用，并探讨了它们的作用模式和机理。1 实验部分1.1 仪器和试剂Nicolet 170SX 型红外光谱仪，美国 Nicolet 公司；乌式粘度计 (粘度系数0.60.7) ；CHI 832 电化学分析仪，上海辰华仪器公司；Cary
4、50 probe 紫外-可见分光光度计，澳大利亚 Varian 公司。鲱鱼精 DNA 购自北京经科试剂公司，用紫外光谱检验其纯度，即 A260/A280 1.80 表示纯度符合 DNA 与蛋白质完全分离的要求； DNA 浓度以核苷酸表示，通过计算 DNA 在 260 nm 处吸光度来确定(摩尔吸光系数 260=6600 mol/L/cm) 5。其它用于合成的试剂均为分析纯，通过商业渠道购买。实验用水为二次蒸馏水。1.2 实验方法1.2.1 水溶性纳米级壳聚糖的合成 本文采用双氧水氧化降解壳聚糖制备水溶性纳米壳聚糖，其制备过程如图 1 所示。图 1 水溶性壳聚糖合成路线量取 5 mL 36%乙酸
5、加入 250 mL 锥形瓶，同时加入 100 mL 水，然后加入 5 g 壳聚糖振摇至完全溶解后，将溶液转移至三颈烧瓶中，水浴加热至所设温度80 ，打开分液漏斗，在搅拌下按设定的用量比 R =2 (H2O2 与糖单元摩尔比)滴加 30% H2O2 6.34 mL。反应 2 h 时间后停止反应，用 2 mol/L NaOH 调节 pH 值至中性，冷却抽滤，得到水不溶性壳聚糖。滤液在 50 以下减压浓缩至 20 mL左右，然后加入 3 倍量乙醇(体积分数) 放置过夜，抽滤，真空干燥，得到水溶性壳聚糖。1.2.2 纳米壳聚糖金属配合物(CHT-M)的制备 准确称取低分子量水溶性壳聚糖0.322 g，
6、溶于适量的去离子水中，滴入 20 mL 0.37 g CuAc 的溶液，于 50 水溶液中搅拌回流 1 h，浓缩后，加入丙酮 20 mL，析出沉淀，过滤洗涤，干燥后得到粗产物，用无水甲醇进行重结晶，真空干燥后得到粉末状蓝绿色铜盐的配合物。1.2.3 壳聚糖脱乙酰度及平均分子量的计算 采用酸碱滴定 6和一点法（MarkHouwink 方程） 7分别计算得到的水溶性产物的脱乙酰度及平均分子量。1.2.4 DNA 结合实验1.2.4.1 紫外可见光谱实验 取一定量 CHTCu 于比色管中，加入 2 mL 0.2 mol/L Tris-HCL 缓冲溶液和 1 mL 0.1 g/LDNA 溶液摇匀反应
7、10 min，然后以相同量的DNA 做空白，在 200-400 nm 处进行电子吸收光谱扫描。1.2.4.2 粘度法 测定粘度时，将温度恒定在 (30+0.1)oC。测试液相对粘度按下列公式计算 8：=(t - t0)/ t0其中 t0 为缓冲溶液流经毛细管所需的时间，t 为 DNA 溶液(含浓度不等的配合物)流经毛细管所需的时间。 0 为未加配合物时 DNA 溶液的相对粘度，以(/ 0)1/3 对加入配合物的浓度作图，可以观察到配合物对 DNA 相对粘度的影响。1.2.4.3 电化学法 电极预处理：先用金相砂纸将玻碳电极打磨平滑，再在麂皮上用 0.05 m -Al2O3 粉末抛光成镜面， 然
8、后在超声波水浴中依次用二次蒸馏水和丙酮溶液彻底清洗。在 10 mL 比色管中依次加入一定量 CHTCu、DNA 溶液和 pH 7.0 Tris-HCL缓冲溶液，定容摇匀，静置充分反应，记录循环伏安曲线(CV)。2 结果与讨论2. 1 纳米级水溶性壳聚糖的物化表征取少量固体产物放于二次蒸馏水中超声振荡 23 min 即可得到透明淡黄色水溶液，表明我们制得的低聚壳聚糖具有优良的水溶性。这可能是由于经过氧化氢氧化降解后，分子链长度减弱，分子量下降，导致分子链上游离的氨基的水合作用增强。按照公式计算得水溶性壳聚糖的脱乙酰度为 90.4%。根据 Mark-Houwink 方程，经过计算的 90.4%左右
9、脱乙酰的水溶性壳聚糖的分子量约为5.2103。对配合物和水溶性壳聚糖进行了红外光谱分析。对照低分子量水溶性壳聚糖及其配合物的红外吸收峰，发现二者主要吸收峰大体相似。配合物在 3 0003 500 cm-1 处 NH 弯曲振动减弱， 1 150 cm-1 的 CN 收缩峰强度减弱，1 410 cm -1 处的 CN 峰也消失，说明 NH2 基中的原子参加了配位作用，形成较强的N-Cu 键。在 1 050 cm -1 处的 C-OH 峰强度和位置无明显变化,说明羟基的配位作用不强。2.2 DNA 结合实验2.2.1 紫外可见光谱图/nm图2 DNA对配合物紫外吸收光谱的影响吸收光谱是研究配合物与D
10、NA 作用最常用的方法之一。金属配合物在紫外区有一吸收峰，当配合物与DNA 结合后，其电子结构会受到DNA 的扰动，导致其配体所处环境发生改变， 配合物与DNA 的结合强弱可通过光谱变化的幅度反映出来。配合物与DNA 作用的吸收光谱如图2所示。从图2中可见，以缓冲溶液作空白，CHT在270 nm 左右有较强的特征吸收峰。当向配合物中加入DNA后 ，配合物的吸收光谱出现了明显的减色效应，表明二者发生了相互作用。abA另外，特征吸收峰有轻微的红移现象，说明配合物可能是通过插入方式与DNA结合的 8。2.2.2 粘度法0.81.01.21.41.61.80.0000 0.0005 0.0010 0.
11、0015 0.0020 0.0025CCu/(g/L)图 3 CHTCu 浓度对 DNA 相对粘度的影响在缺少高精度晶体结构数据和核磁数据的情况下，粘度这种对 DNA 长度变化比较敏感的流体力学方法是检测溶液状态下配合物与 DNA 作用模式的最有效的手段 9。一般来讲，当小分子配合物以插入模式与 DNA 作用时，DNA的相邻碱基对的距离会变大以容纳插入配体，因而导致 DNA 双螺旋伸长，DNA 溶液的粘度增加；当配合物以静电或沟面结合等非插入模式与 DNA 作用时， DNA 溶液的粘度无明显变化。在本实验中，CHTCu 与 DNA 作用后对DNA 溶液粘度的影响如图 3 所示。由图可知，DNA
12、 溶液的粘度随着配合物浓度的增加而增大，这种影响效果与已知的 DNA 经典插入试剂Ru(bpy) 2dppz2+和Ru(phen) 2dppz2+(bpy=2，2联吡啶，dppz=二吡啶并 3，2-a:2 ，3-c 吩嗪) 9等相似，表明 CHTCu 可与 DNA 以插入模式相互作用，证实了电子吸收光谱实验结果。t / min(/o)1/3(/o)1/32.2.3 电化学E/V图 4 0.015 g/L CHTCu (a)与 0.002 g/L DNA 相互作用的循环伏安图图 4 是 CHTCu 与 DNA 在 pH=7.0 的 Tris-HCl 缓冲溶液中相互作用的循环伏安图。如图 4 所示
13、，在电位区间-0.60.1 V 范围内，CHTCu 在-0.04 V 和 0.36 V 有一对对应于 CuII/I 的氧化还原峰，峰电位差 E =320 mV，氧化峰电流与还原峰电流比值1，表明该配合物在电极表面的电化学响应为一不可逆过程。因为氧化峰电流明显比还原峰电流灵敏，在下面的电化学实验中，我们都以在-0.04 V 处的氧化峰为分析对象。在配合物中加入 DNA 后，铜配合物的氧化还原峰均出现了明显的降低(图4a)，这说明配合物与 DNA 发生了强的键合作用，导致溶液中自由配合物浓度降低，单位时间里迁移到电极表面的配合物分子数下降，最终使得峰电流减小10除了明显的峰电流的降低以外，我们还观
14、察到，加入 DNA 后，氧化峰峰电流出现了明显的正移。根据文献 11通过电化学方法研究外源小分子与 DNA相互作用时得到的结论：当外源小分子与 DNA 结合后，峰电流降低且峰电位出现正移，表明小分子通过嵌插方式与 DNA 结合；而当峰电流降低且峰电位出现负移，表明小分子与 DNA 通过静电模式结合，我们推断，本实验中的配合物与 DNA 结合模式中也存在嵌插作用。I/10-6Aab2.2.4 工作曲线0.00.20.40.60.81.01.20.000 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015CDNA/ (g/L)图 5 峰电流的降低值 Ip与 CDNA关系曲线在最佳反应条件下
15、，固定 CHTCu 的浓度为 0.015 g/L，加入不同量的DNA，配合物的氧化峰电流逐渐降低，当 DNA 浓度达到 0.030 g/L 时，峰电流达到最低值，然后趋于稳定，说明 CHTCu 与 DNA 的相互作用达到饱和。将峰电流的降低值 Ip 对加入 DNA 的浓度 CDNA 作图发现 Ip 与 DNA 浓度在0.0010.012 g/L 范围内呈良好的线性关系(图 5)，线性回归方程 Ip/(10-6A) =78.05CDNA/(g/L)+0.125， =0.997。3 结论在本实验中，我们用氧化降解的方法将难溶于水的大分子壳聚糖降解成了易溶于水的低聚壳聚糖及其铜配合物，采用多种方法对
16、产物进行了物理和化学性质的表征。采用光谱法、粘度法和电化学方法研究了壳聚糖配合物 (CHTCu)与 DNA 的相互作用，实验结果表明配合物与 DNA 能够通过嵌插作用结合。Ip/10-6A参考文献1Inoue K, Yoshizuka K, Ohto K. Analytica Chimica Acta, 1999, 88: 209-2 l 82Liu X P, Zhang J B, Wang W J. Chinese Beijing Univ. (Nat. Sci., E ), 2003, 9: 880-8873胡道道, 启祯 , 唐宗薰. 无机化学学报, 2000, 16: 385-3944
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