1、收 稿 日 期 : 2005208215作 者 简 介 : 杨 学 明 (19692) , 男 , 四 川 射 洪 人 , 助 理 研 究 员 , 主 要 从 事 动物 遗 传 育 种 与 生 物 技 术 研 究 。3 广 西 科 学 基 金 项 目 (桂 科 自 0542035)资 助 。广 西 科 学 Guangxi Sciences 2006, 13 (1) : 76 80转 基 因 鱼 的 研 究 及 其 发 展 前 景 3Progress in Tran sgen ic F ish Breeding Research杨 学 明 1, 张 立 1, 蒋 和 生 2YAN G Xue2m
2、 ing1, ZHAN G L i1, J IAN G H e2sheng2(1. 广 西 水 产 研 究 所 , 广 西 南 宁 530021; 2. 广 西 大 学 动 物 科 技 学 院 , 广 西 南 宁 530005)(1. Guangxi F isheries Institute,N anning, Guangxi, 530021, Ch ina; 2. Faculty of A nim al Science andT echnology, GuangxiU niversity,N anning, Guangxi, 530005, Ch ina)摘 要 : 20年 来 国 内 外
3、主 要 进 行 了 快 速 生 长 转 基 因 鱼 、 抗 寒 (耐 寒 )转 基 因 鱼 、 抗 病 转 基 因 鱼 和 其 他 抗 性 转 基 因 鱼 的研 究 , 常 用 的 鱼 类 基 因 转 移 技 术 有 显 微 注 射 法 、 精 子 载 体 法 、 电 穿 孔 法 、 基 因 枪 法 、 胚 胎 干 细 胞 载 体 、 脂 质 体 法 和缺 陷 性 病 毒 感 染 法 等 基 因 转 移 方 法 。 转 基 因 鱼 的 安 全 性 和 遗 传 稳 定 性 有 望 通 过 进 一 步 的 科 研 攻 关 得 到 解 决 , 转基 因 鱼 的 生 产 应 用 前 景 广 阔 。关
4、键 词 : 转 基 因 鱼 显 微 注 射 基 因 打 靶中 图 法 分 类 号 : Q 95313 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 100529164 (2006) 0120076205Abstract: R esearches in transgenic fish in the past two decades hom e and abroad are m ainly concen2trated on several aspects including fast2grow th transgenic fish, antifreeze freeze2resistant tra
5、nsgenicfish and antidisease transgenic fish. O ften used technologies for gene transfer in fish are sperm m edi2ated gene transfer, electroporation, particle gun, em bryonic stem cell insertion, liposom es, retrovirusinfection, and so on. T he safey and heredity stability of transgcnic fish could be
6、 lifted and finallysolved th rough further research. T ransgenic fish have broad and brigh t p rospects in its future app li2cation.Key words: transgenic fish,m icroingection, gene targetting鱼 类 是 脊 椎 动 物 门 中 种 类 最 多 的 一 个 类 群 , 是 人类 的 重 要 蛋 白 质 来 源 , 人 们 一 直 在 寻 求 培 育 生 长 快 、抗 病 力 强 的 鱼 类 品 种 , 基 因
7、 工 程 技 术 的 应 用 为 达 到 这一 目 的 提 供 了 可 能 。 1982年 , Palm iter 等 1 把 生 长 激素 基 因 注 入 小 鼠 受 精 卵 原 核 , 获 得 了 “ 超 级 鼠 ” , 显 示了 基 因 工 程 技 术 育 种 的 巨 大 潜 力 。 1984年 , 我 国 科 学家 获 得 了 转 基 因 金 鱼 (Carassius au ratus) 2 , 经 过 20年 的 发 展 , 现 在 我 国 的 转 基 因 研 究 和 应 用 已 处 于 世 界领 先 水 平 。 当 前 国 际 鱼 类 转 基 因 技 术 的 应 用 趋 势 主 要
8、还 是 围 绕 三 个 方 面 进 行 : 一 是 培 育 高 产 品 种 , 提 高 生长 速 度 和 饵 料 转 化 率 , 增 加 产 量 ; 二 是 培 育 抗 逆 (病害 、 寒 冷 ) 品 种 , 改 善 抗 病 和 抵 御 恶 劣 环 境 条 件 的 能力 ; 三 是 作 为 科 学 研 究 的 模 式 动 物 进 行 基 础 研 究 , 探讨 发 育 、 生 长 、 繁 殖 等 机 理 , 目 前 研 究 应 用 最 多 、 最 重要 的 转 基 因 模 式 鱼 是 斑 马 鱼 (D anio rerio) 和 剑 尾 鱼(X ip hop horus helleri) , 近
9、 年 中 国 科 学 院 水 生 生 物 研究 所 又 发 现 了 稀 有 鲫 (Gobiocy p ris rarus) 这 一 我 国特 有 的 、 新 的 模 式 动 物 3 。 本 文 综 述 20年 来 国 内 外 转基 因 鱼 的 研 究 进 展 和 常 用 的 鱼 类 基 因 转 移 技 术 , 并 探讨 转 基 因 鱼 的 安 全 性 、 遗 传 稳 定 性 及 其 发 展 前 景 。1 国 内 外 转 基 因 鱼 研 究 概 况自 1984年 以 来 , 中 国 科 学 院 水 生 生 物 研 究 所 先 后进 行 了 泥 鳅 (M isg u rnus ang u illi
10、caud atus)、 鲤 鱼(cy p rinus carp io)、 鲫 鱼 (Carassius au ratus) 等 的 转 基因 研 究 , 建 立 了 鱼 类 的 转 基 因 模 型 4 。 此 后 , 世 界 上 先后 获 得 转 基 因 青 (O ry z ias latip es)、 虹 鳟(O ncorhy nchus m y kiss)、 沟 鲶 (Ictalu rus p unctatus)、 鲑鱼 (S alm o salar)、 斑 马 鱼 、 罗 非 鱼 (T ilap ia)、 白 斑 狗 鱼(E sox lucius)、 非 洲 鲶 鱼 (C larias
11、g ariep inus)、 大 鳞 大麻 哈 鱼 (O ncorhy nchus tshaw y tscha)、 大 麻 哈 鱼(O ncorhy nchus keta)、 银 大 麻 哈 鱼 (O ncorhy nchuskisu tch) 等 5, 6 。 这 些 转 基 因 鱼 所 使 用 的 转 移 基 因 主 要有 三 类 : 生 长 激 素 (GH )基 因 、 抗 冻 蛋 白 (A FP) 基 因 和67 Guangxi Sciences,V ol113 N o11, February 2006某 些 作 为 标 记 用 的 报 告 基 因 , 如 水 母 荧 光 蛋 白 (G
12、FP)基 因 。 部 分 目 前 已 报 道 的 转 基 因 鱼 及 其 外 源 基 因 构 成见 表 17 。表 1 各 种 转 基 因 鱼 及 使 用 的 转 基 因 构 件Table 1 Var iety of tran sgen ic f ish and the ir tran sgene ele-men ts used鱼 名F ish结 构 基 因 标 记 基 因Structural gene M arker gene增 强 子- 启 动 子Enhancer2p romoter表 达 证 据Exp ression虹 鳟O ncorhy nchusm y kisshGHcDNA SV
13、40 -hGHcDNA mM T 21 +泥 鳅M isgurnusanguillicaudatushGHcDNA mM T 21 +鲫CarassiusauratushGHcDNA mM T 21 -大 西 洋 鲑S alm o salarhGHcDNA mM T 21 +csGHcDNA opA FP +w fA FP w fA FP -斑 IctaluruspunctatushGHcDNA mM T 21 -罗 非 鱼T ilap iahGHcDNA mM T 21 -青 O ry z iaslatipescD2crystalin cD2crystalin +大 眼 梭 鲈S tizos
14、ted ionv itreumhGHcDNA RSV 2L TR +csGHcDNA cB2actin +白 斑 狗 鱼E sox luciushGHcDNA RSV 2L TR +鲤cy p rinuscarp iortGHcDNA RSV 2L TR +白 斑 狗 鱼E sox luciuscsGHcDNA cB2actin +大 麻 哈 鱼O ncorhy nchusketacsGHcDNA cB2actin +斑 马 鱼D anio rerioB2gal(大 肠 杆 菌 )B- gal(Colibacillus)CMV +CA T cB2actin +荧 光 素 酶L uciferas
15、eRSV 2L TR +h (b, rt, cs) GH: 人 (牛 , 虹 鳟 , 大 鳞 大 麻 哈 鱼 ) 生 长 激 素 ; SV 40: 猿猴 病 毒 40增 强 子 ; mM T: 小 鼠 金 属 硫 蛋 白 增 强 子 ; cD2crystalin: 鸡 D2晶体 蛋 白 启 动 子 ; RSV 2L TR: 劳 斯 肉 瘤 病 毒 长 末 端 重 复 序 列 ; cB2actin: 鲤B2肌 动 蛋 白 增 强 子 + 启 动 子 ; w f (op)A FP: 美 洲 黄 盖 鲽 (美 洲 大 绵 尉 )抗 冻 蛋 白 ; B2gal: B2半 乳 糖 苷 酶 ; CA T:
16、 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 ; CMV: 巨 细胞 病 毒 增 强 子 启 动 子 。h (b, rt, cs) GH: Grow th hormone of Hum an (Bull, Rainbow trout,Chinook salmon) ; SV 40: Sim ian vacuolating virus 40 enhancer; mM T:M ice m etallothionein enhancer; cD2crystalin: Chicken D2crystalin p romot2er; RSV 2L TR: Long term inal repeats of Rous
17、 sarcom a virus; cB2actin:Common carp B2actin enhancer and p romoter; w f (op ) A FP: A ntifreezep rotein of W inter flounder (O cean pout) ; B2gal: B2galactosidase; CA T:A cetyltransferase; CMV: Cytom egalovirus enhancer p romoter.1. 1 快 速 生 长 转 基 因 鱼 研 究快 速 生 长 转 基 因 鱼 品 种 主 要 是 通 过 转 移 外 源 生长 激 素
18、 (GH )基 因 获 得 。 转 GH 基 因 鱼 生 长 速 度 快 , 饵料 转 化 率 高 , 是 21世 纪 解 决 世 界 粮 食 短 缺 问 题 的 又 一重 要 途 径 , 目 前 国 内 外 相 关 研 究 报 道 很 多 。 朱 作 言等 8 首 先 进 行 鱼 类 生 长 激 素 转 基 因 研 究 , 采 用 显 微 注射 方 法 , 把 小 鼠 重 金 属 结 合 蛋 白 基 因 启 动 子 与 人 生 长激 素 基 因 序 列 的 重 组 DAN 片 段 , 注 入 泥 鳅 的 受 精卵 , 该 研 究 证 明 了 外 源 基 因 可 以 通 过 生 殖 细 胞 传
19、 递 给后 代 , 并 显 示 出 不 同 程 度 的 快 速 生 长 效 应 。 该 研 究 小组 还 首 次 建 立 了 一 个 高 效 、 简 洁 而 且 完 整 的 转 基 因 鱼模 型 , 它 为 鱼 类 基 因 工 程 定 向 育 种 新 技 术 奠 定 了 实 验基 础 4 。 1992年 我 国 又 培 育 出 转 基 因 鲤 鱼 , 其 最 大 个体 体 重 是 对 照 个 体 的 2倍 9 , 转 GH 基 因 大 麻 哈 鱼 个体 甚 至 达 到 对 照 的 10 30倍 10 。 吴 婷 婷 等 11 采 用 显微 注 射 方 法 , 将 带 有 小 鼠 M T 21启
20、 动 子 与 人 生 长 激 素基 因 序 列 重 组 的 线 状 DNA 片 段 , 注 入 团 头 鲂(M eg alobram a am bly cep hala Y ih) 和 鲤 的 受 精 卵 , 获得 了 成 活 的 实 验 鱼 , 经 斑 点 杂 交 、 Southern 杂 交 、N orthern 杂 交 、 放 射 免 疫 和 酶 联 等 方 法 检 测 , 表 明 外源 基 因 在 受 体 鱼 中 得 到 整 合 、 转 录 和 表 达 , 并 表 现 出一 定 的 促 生 长 效 应 ; 而 且 , 转 基 因 雌 鱼 和 雄 鱼 有 性 繁殖 所 获 得 的 子 代
21、 带 有 外 源 基 因 , 表 明 外 源 基 因 能 通 过性 细 胞 传 给 子 代 , 并 仍 具 促 生 长 效 应 。 代 谢 补 偿 试 验证 实 转 基 因 鲤 鱼 表 达 的 hGH 能 代 偿 内 源 GH , 刺 激去 垂 体 鱼 继 续 生 长 , 而 去 垂 体 的 普 通 对 照 鱼 则 停 止 生长 12 。目 前 , 用 于 转 移 人 、 牛 、 羊 等 哺 乳 类 动 物 的 GH 基因 已 逐 渐 被 抛 弃 , 而 “ 全 鱼 ” 基 因 的 概 念 逐 渐 为 学 术 界所 广 泛 接 受 , 并 迅 速 成 为 一 个 新 的 研 究 热 点 。 所
22、 谓 “ 全鱼 ” 基 因 , 是 指 构 成 转 基 因 的 所 有 元 件 , 包 括 启 动 子 、增 强 子 和 外 源 目 的 基 因 等 全 部 来 自 鱼 类 自 身 7 。 因 为小 鼠 金 属 硫 蛋 白 基 因 M T 启 动 子 需 要 在 水 体 或 饵 料中 添 加 重 金 属 , SV 40病 毒 启 动 子 也 会 使 消 费 者 产 生心 理 上 的 恐 慌 和 顾 虑 , 另 外 , 已 有 研 究 表 明 小 鼠 M T启 动 子 在 鱼 细 胞 中 的 启 动 效 率 仅 及 鲤 鱼 M T 启 动 子的 50% 13 , 综 合 几 方 面 因 素 考
23、虑 , 使 用 “ 全 鱼 ” 基 因 有助 于 提 高 转 基 因 鱼 外 源 基 因 表 达 的 效 率 和 安 全 性 。 目前 已 构 建 了 鲤 鱼 、 草 鱼 (C tenop hary ng od on id ellus)和 鲑 鱼 GH 的 “ 全 鱼 ” 基 因 14 , 常 用 启 动 子 是 鲤 鱼 B2肌 动 蛋 白 基 因 启 动 子 和 大 西 洋 条 鳕 (M acrozoarcesam ericanus) 的 抗 冻 蛋 白 基 因 启 动 子 15 。1. 2 抗 寒 (耐 寒 )转 基 因 鱼 研 究抗 寒 (耐 寒 ) 转 基 因 主 要 是 通 过 转
24、移 冷 水 性 鱼 类的 抗 冻 蛋 白 (A FP) 基 因 到 其 它 鱼 类 如 热 带 鱼 体 内 来实 现 。 抗 冻 蛋 白 具 有 降 低 胞 内 溶 液 凝 固 点 的 作 用 , 能够 有 效 提 高 鱼 类 在 寒 冷 地 区 或 高 寒 山 区 的 生 存 适 应77广 西 科 学 2006 年 2 月 第 13 卷 第 1 期能 力 , 延 长 它 们 的 生 长 期 , 从 而 能 够 相 应 提 高 了 鱼 类产 量 。 世 界 范 围 内 热 带 和 温 水 性 鱼 占 鱼 类 种 类 的 70%以 上 16 , 提 高 鱼 类 的 抗 寒 能 力 的 重 要 性
25、 是 不 言 而 喻的 。 此 外 , 某 些 冷 水 性 经 济 鱼 类 如 鲑 、 虹 鳟 等 体 内 也 缺乏 抗 冻 蛋 白 , 把 美 洲 黄 盖 鲽 (P seud op leu ronectesam ericanus) 的 抗 冻 蛋 白 注 入 到 虹 鳟 体 内 , 其 抗 冻 能力 显 著 增 强 5 。 把 美 洲 大 绵 (M acrozoarcesam ericanus) A FP 基 因 转 入 鲫 鱼 , 转 基 因 鲫 鱼 获 得 了耐 寒 性 , 0 时 转 基 因 鲫 鱼 33% 存 活 , 而 对 照 鱼 全 部 死亡 6 , 说 明 抗 冻 蛋 白 基
26、因 能 在 抗 寒 方 面 发 挥 重 要 作用 。1. 3 抗 病 转 基 因 鱼 研 究可 选 择 的 新 目 的 抗 病 基 因 相 当 多 , 如 转 某 些 反 义RNA、 核 酸 、 抗 体 、 干 扰 素 、 溶 菌 酶 等 基 因 , 以 提 高 鱼类 的 抗 病 能 力 , 通 过 提 高 鱼 类 的 抗 病 力 来 提 高 鱼 类 的养 殖 成 活 率 , 从 而 使 产 量 得 到 提 高 。 对 于 转 基 因 鱼 类和 虾 类 抗 病 新 品 种 , 目 前 国 内 外 报 道 还 不 多 , 国 内 纪伟 等 17 通 过 精 子 载 体 法 获 得 了 转 全 鱼
27、 溶 菌 酶 基 因 大菱 鲆 (S cop h thalm us m ax im us) , R ex 等 18 将 惜 古 比天 蚕 (Cecrop ia m oth) 的 抗 菌 肽 Cecrop in B 基 因 导 入到 斑 点 叉 尾 (Ictalu rus p unctatus) , 获 得 的 子 代 鱼抗 病 原 菌 能 力 明 显 增 强 。1. 4 其 他 转 基 因 鱼 类 研 究此 外 , 转 催 乳 素 基 因 改 善 鱼 类 渗 透 压 调 节 功 能 ,转 珠 蛋 白 基 因 增 强 鱼 类 耐 低 氧 能 力 , 以 及 转 生 长 激 素释 放 因 子 基
28、因 增 强 抗 逆 性 , 也 是 转 基 因 的 方 向 之 一 ,不 过 , 目 前 对 这 些 基 因 的 了 解 还 比 较 少 , 相 关 报 道 也很 少 。2 鱼 类 基 因 转 移 技 术显 微 注 射 (M icroinjection) 是 迄 今 为 止 最 有 效 的鱼 类 基 因 转 移 方 法 , 目 前 的 绝 大 多 数 转 基 因 鱼 都 是 通过 基 因 显 微 注 射 而 获 得 的 2, 4, 5, 8, 9, 14 。 此 外 , 还 有 精 子载 体 法 、 电 脉 冲 介 导 法 、 基 因 枪 法 、 脂 质 体 转 染 法 和 反转 录 病 毒
29、感 染 法 等 基 因 转 移 方 法 , 详 见 表 2。精 子 载 体 法 是 较 为 简 便 的 转 基 因 方 法 , 用 该 法 可对 一 些 不 适 于 显 微 注 射 的 鱼 类 进 行 基 因 转 移 。 L avit2rano 等 19 首 先 用 精 子 作 为 载 体 进 行 了 小 鼠 基 因 转移 。 从 鱼 到 哺 乳 动 物 , 精 子 载 体 法 获 得 的 转 基 因 动 物仍 是 嵌 合 体 型 。 Khoo 等 20 用 精 子 和 DNA 温 育 后 授精 的 方 法 得 到 转 基 因 斑 马 鱼 。 在 我 国 , 用 精 子 做 载表 2 目 前
30、常 用 的 几 种 转 基 因 方 法Table 2 M a in methods of gene tran sfer used a t presen t转 基 因 方 法M ethods oftransgenic原 理 及 操 作P rincip les 背 、 腰 及 翅 上 覆羽 橄 榄 绿 黄 色 , 颈 羽 较 淡 ; 飞 羽 黑 色 , 翅 上 具 宽 阔 的 亮黄 色 翅 斑 ; 次 级 飞 羽 具 白 色 羽 端 ; 翅 上 覆 羽 橄 榄 黄 色 ,尾 羽 黑 色 , 除 中 央 尾 羽 外 , 其 余 尾 羽 基 部 金 黄 ; 尾 上 覆羽 橄 榄 黄 色 , 显 较 腰
31、 部 为 淡 ; 颏 、 喉 和 胸 部 橄 榄 黄 色 ,腹 部 锈 色 , 尾 下 覆 羽 亮 黄 色 。 虹 膜 黑 褐 色 ; 嘴 、 跗 肉红 色 。黑 头 金 翅 雀 在 全 世 界 仅 有 两 个 亚 种 分 化 , 都 见 于我 国 5 。 指 名 亚 种 (Card u lis am big ua am big ua) 分 布于 四 川 西 部 和 西 南 部 , 贵 州 西 南 部 , 云 南 西 部 和 东 南部 , 青 海 东 北 部 及 西 藏 的 察 隅 。 西 藏 亚 种 (Card u lisam big ua tay lori) 分 布 在 西 藏 南 部 偏
32、 东 地 区 , 昌 都 地区 西 南 部 , 西 藏 中 部 足 木 宗 。 两 个 亚 种 区 别 在 于 西 藏亚 种 体 色 较 淡 , 而 指 名 亚 种 体 色 较 浓 6 。 我 们 采 到 的标 本 为 指 名 亚 种 。黑 头 金 翅 雀 在 其 已 知 分 布 区 均 为 留 鸟 , 尚 未 有 季节 性 迁 徙 的 记 录 7 , 故 其 在 广 西 亦 应 为 留 鸟 。参 考 文 献 :1 广 西 动 物 学 会 . 广 西 陆 栖 脊 椎 动 物 分 布 名 录 M . 桂 林 :广 西 师 范 大 学 出 版 社 , 1978.2 李 桂 垣 , 郑 宝 赉 ,
33、刘 光 佐 . 中 国 动 物 志 鸟 类 : 第 13卷M . 北 京 : 科 学 出 版 社 , 1982: 16218. 3 郑 作 新 . 中 国 鸟 类 系 统 检 索 M . 第 3版 . 北 京 : 科 学 出 版社 , 2002: 2692270. 4 杨 岚 , 杨 晓 君 . 云 南 鸟 类 志 (下 卷 ): 雀 形 目 M . 昆 明 : 云南 科 学 技 术 出 版 社 , 2004: 6912692. 5 HOWA RD R , A MOOR E. A comp lete check list of thebirds of the world M . London: O xford U niversityP ress, 1984.6 傅 桐 生 , 宋 榆 钧 , 高 玮 , 等 . 中 国 动 物 志 鸟 纲 : 第 14卷M . 北 京 : 科 学 出 版 社 , 1998: 1712173. 7 RODOL PH E M EYER. The bird of Ch ina M . London:O xford U niversity P ress, 1984.(责 任 编 辑 : 韦 廷 宗 ) 08 Guangxi Sciences,V ol113 N o11, February 2006
