1、第49卷第6期 2010年6月 湖北农业科学 Hubei Agricultural Sciences Vo149 No6 Jun2O10 斑马鱼胚胎毒理学研究进展 陈粉丽张松林，李运彩 (西北师范大学地理与环境科学学院，兰州 730070) 摘要：斑马鱼胚胎作为一种模式生物，具有很多其他模式生物所不具备的优点，已被广泛应用于生物学 各领域，具有十分广阔的发展前景。介绍了斑马鱼胚胎的生物学优点及其在化学物质毒性和致畸性研 究、心血管研究、内分泌干扰研究和基因抑制技术研究等方面的进展。 关键词：斑马鱼(Brnchydanio rerio)；胚胎；毒理学；ate；进展 中图分类号：$9651；R99
2、 文献标识码：A 文章编号：04398114(2010)06148404 Advances in Toxicology Research on Zebrafish Embryos CHEN Fen-li，ZHANG Song-fin，LI Yun-cai (College of Geography and Environmental Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China) Abstract：As a model organism，zebrafish embryos have many advantages compar
3、ed with other model organisms，and have been used widely in various biological fields with vast potential for future developmentThis paper introduced the biological advantages of zebrafish embryos and research progresses in chemical toxicity and teratogenicity，cardiovascular disease，en- docfine disru
4、ption and gene suppression Key words：zebrafish；embryo；toxicology；research；progress 每年工业和农业生产都要排出45 400 t的化学 物质大多数化学物质最终分散到空气和地下水 中。其中许多物质具有发育毒性和致畸作用。斑马 鱼胚胎和幼鱼对有害物质非常敏感可用于研究环 境物质对发育的影响及作用机制 经济合作发展 组织(OECD)将斑马鱼列为健康毒性和环境毒性检 测标准(http：wwwoecdorg)。国际标准组织 (ISO)已将斑马鱼推荐为河水毒性试验鱼种并制定 了相应的标准(IS007346)利用转基因斑马鱼可
5、以动态监测污染物它们可以响应污染物浓度的变 化而表达出易于看见的荧光3 虽然通过实验室啮齿动物研究可以推断有毒 物质对人类的影响，但存在花费昂贵。试验周期长 且受到法律限制等诸多问题 目前已经用一些替代 的模式生物来研究基因、受体和分子过程。其中无 脊椎动物有果蝇和线虫脊椎动物有青鳄、斑马鱼、 青蛙和老鼠。而斑马鱼凭借其独特的优点，有望取 代果蝇、青蛙、老鼠等作为试验材料，发展前景十分 广阔。从近来发表的有关斑马鱼渐增的文献可以得 知2O世纪9O年代初每年发表的有关斑马鱼的文 献少于100篇，世纪之交时增加到大约1 000篇，而 现在每年平均有3 500篇。 1 斑马鱼胚胎相对优势 斑马鱼的优
6、点：斑马鱼亲鱼体型小，易于管 理早期形态便于观察极大地减少了饲养空间和 管理成本。此外，还减少了试验所需的试剂量(化学 物质、药品、污染物)和产生的废液量，用药简单。只 需将药物放入养殖胚胎的水中或快速注射：用药量 很少 产卵量大，一尾雌鱼一般每次可产卵100 300枚每周可产卵1次斑马鱼胚胎试验可在单个 细胞培养板或一系列的细菌培养皿中进行测试动 物样本数可以很大以确保统计学意义上的显著 性。测试周期短，一般不超过1周，从受精卵开 始斑马鱼胚胎能够在24孔板中存活好几天，其通 过卵黄囊吸收营养并可清楚的看到致畸等现象。 收稿13期：20090925 基金项目：西北师范大学地理与环境科学学院青
7、年教师科研基金项目(ZS011-A25063一Y)；甘肃省自然科学基金项目(2007GS03614) 作者简介：陈粉丽(1978一)，女，云南曲靖人，讲师，硕士，研究方向为环境毒理学，(gii)13609397249(电子信箱)chenfenli1102163com。 第6期 陈粉丽等：斑马鱼胚胎毒理学研究进展 斑马鱼胚胎具有光学透明性，可清楚地看到各个 发育阶段突变筛选时可鉴别表型特征毒理测试 时可方便评价毒理学终点。因为斑马鱼的光学透 明性光学显微镜可穿透其组织看到基因表达。这 种方法应用到斑马鱼心血管系统中可展现不同芳 香烃受体(AHR)和芳香烃受体核易位子(ARNT) MRNAS的共定
8、位 应用到原位杂交技术(ISH) 和免疫化学技术(IHC)中。实验室中普遍使用 Digoxigenin一标记的RNA原位杂交探针来筛选化学 物质诱导的畸形(以特定基因形式表达)。比如对 暴露在卤化芳香烃和多环芳烃中的斑马鱼进行 CYPIA表达的免疫组织化学研究发现心血管系统 的内皮细胞是起作用的细胞位点_5 2斑马鱼胚胎毒理学研究进展 21 化学物质毒性和致畸性研究 国际上早在20世纪80年代初期就制定了针 对化学品生物毒性效应的一系列标准和工作指南 如美国环保署(us，EPA)、国际经济与发展组织 (OECD)及德国标准研究所(DIN)都颁布了一整套 毒性测试的方法 严格规定了对生物的“无害
9、效应 浓度(NOEC)”。在此基础上。也陆续制定了针对判 断污水毒性的标准方法_8_ OECD在1998年将此方 法列入测定单一化学品毒性的标准方法之一并制 定了详细的操作指南(OECDTG212)。此后，该项技 术广泛应用于环境科学研究尤其用于对生态环境 乃至人类安全影响深远的化学物质的毒性和致畸 性的测定l9 211化学物质毒性研究重金属研究。Dave等llo，“ 19861990年间测定了HgC12、Pb(CH3CO0)23H2O、 CuC125H20、NiSO46H20、K2Cr207、ZnSO47H20和 CoC16H，O在标准条件下(重蒸水的硬度为100 mgL CaCO ，DH值
10、为75 77)的斑马鱼胚胎和幼鱼的毒 性。从囊胚阶段(产卵24 h后)开始染毒，每日观察 化合物对孵化和存活的影响，持续观察16 d。与Co、 Pb、Hg、Zn、Cr相比，Cu和Ni是特定孵化抑制剂。从 剂量一反应关系计算的孵化时间和存活时间的 NOEC、LOEC的几何平均值(GMNOECLOEC)。其 中Ni、Hg,Pb的无效应浓度与以前报道的敏感鱼种 成鱼的MATC值一致。Cu的无效应浓度较之低12 个数量级 产生差异的主要原因可能是所用的重蒸 水中存在的有机物可以与Cu离子结合。有机农 药研究。近1O年来各国研究人员采用斑马鱼胚胎 技术测定并积累了各类有机农药的胚胎毒性数据 莠去津的C(
11、48 h)为169 txmolL，马拉硫磷的 LC50(48h)为16 IxmolL，胺甲萘的C50(48h)为20 txmolL，林丹的 G卯(48h)为8 pmolL，三苯基锡醋酸 脂LC，(48h)为018moD 。有机试剂研究。大 量有机试剂在环境中普遍存在成为毒理学工作者 的研究重点斑马鱼胚胎技术更是得到了广泛的应 用经过大量的实验研究得出：溴化十六碳烷基 三甲胺的 C钔(48 h)为1 molL，2，4一二硝基苯 酚的 C(48 h)为3 molL，4一苯胺的LC50(48 h)为6 molL。35一二氯苯酚的LC(48 h)为12 molL，3，4一 二氯苯胺的C钔(48 h)为
12、15 molL，十二烷基磺酸钠 的LC(48 h)为20 molL，4一硝基苯酚的C如(48 h) 为40InolL，4一硝基苯甲酸的LC(48h)为154molL， 2一硝基苯胺的 C铀(48 h)为177 molL13。多元混 合物研究 斑马鱼胚胎技术还被应用于测定硝基麝 香_14微囊藻素一LR和蓝藻初步提取物15、铜络合 物_l6、3，4一二氯苯胺林丹二元混合物17,18，研究其 对发育和种群存活的影响并对其进一步的应用进 行了广泛细致的探讨 212化学物质致畸性研究 斑马鱼也作为检测 环境污染物致畸研究 有学者根据斑马鱼胚胎的毒 理学终点一些参数计算暴露于化学物质后的发育 畸形指数(D
13、evelopment malformation index，DMI)。 丙戊酸(VPA)是一种抗癫痫药物，在怀孕期间服用 导致出生胎儿缺陷 在斑马鱼胚胎试验中暴露于该 物质出现多种发育缺陷。例如。体轴缩短，心脏水肿 和色素斑点减少 乙醇是一种已知的致畸因子当 胚胎在原肠期暴露在一定浓度的乙醇中会产生一 种独眼畸形 人类在怀孕期间暴露于大剂量的乙醇 中也会产生该畸形斑马鱼也作为检测环境污染物 致畸作用。最近有研究报道，Atrazine、DDT、TCDD 具有很强的致畸作用。2，4一D、Dieldrin和Nonylphe nol显示特异的神经毒性Dieldrin和Nonylphenol 主要损害儿
14、茶酚胺能神经元 22心血管研究 人类心脏发育具有旋转和分隔等复杂行为但 它最初的发育模式与斑马鱼心脏相同是形成一条 沿A2P轴定位的结构简单的管道。因此斑马鱼被 认为是研究心血管早期发育的最佳模式生物而且 由于它的早期发育存活不依赖于血液循环因此可 能得到心脏发育或功能缺陷突变体。心率减缓或 加快物质诱导的心率改变可被视为发育缺陷的表 现环境中的毒物TCDD减慢斑马鱼胚胎和幼鱼的 心率_19。肾上腺素作为增加心率的化学物质在斑 马鱼中也表现为心率加快的作用20。心包囊大 小，这是另一个重要的心脏毒性的指标斑马鱼胚 胎暴露于多环芳香烃类物质出现心功能的异常和 心包囊水肿和多种畸形_2】该化合物和
15、某个基因突 1486 湖 北 农 业 科 学 2010正 变产生类似的心脏发育缺陷提示该物质影响了一 个特定的分子信号传导途径。 23内分泌干扰研究 内分泌干扰物fEDCs)对性分化和生殖能力的 影响已经引起了极大关注22-25。近年来有关鱼体内 分泌干扰的报道越来越多，包括雌雄同体、性比失 衡、雄鱼出现卵黄蛋白原(VTG)等。Petersen等将暴 露在EE2中30d的成年雄性斑马鱼制成匀浆利用 酶联免疫法(ELISA)测出不同浓度的VTG。此外， 0lsson等26，27研究表明雌鱼暴露后发现其产下的 胚胎发育受到抑制 将斑马鱼暴露在雌激素类化合 物比如一些PCBs及其代谢物、邻苯二甲酸一
16、 二一2一乙基己基脂(DEHP)中，也发现了类似的影 响 29。有机氯化合物，比如2。3，78一四氯一二苯 基一对一二恶英(TCDD)和毒杀芬，通过与Ah一受体 结合，而不是干扰雌激素受体产生抗雌激素作用， 影响生殖 。雌鱼喂食这些化合物后。每次产卵数 量都会减少并且其后代出现致命畸形31，32 24神经研究 因为传统的神经毒性测试费力又耗时近年 来斑马鱼胚胎被广泛应用于神经研究中。斑马鱼 发育初期的神经元称为原代神经元(Primary neu rons)，是简单神经系统的一部分神经毒性。脑部神 经元的坏死和凋亡可以作为检测神经毒性的指标 有研究通过比较斑马鱼和哺乳动物高度相似的毒 性反应认为
17、斑马鱼可以作为神经毒性筛选的动物 模型，l一甲基一4一苯基一l，2，3，6一四氢毗啶(MPTP) 是一种已知的神经毒素能够通过选择性地破坏黑 质区域的多巴胺能的神经元从而产生帕金森综合 征33 MPTP的神经毒性在不同的物种间具有异质 性：灵长类动物具有高度的敏感性，多种啮齿类包 括大鼠和部分种类的小鼠对MPTP不敏感34 有些 研究称MPTP特异性的损害斑马鱼胚胎和幼鱼的多 巴胺能神经元E35，36观察也是神经毒性反应的一个指 标 斑马鱼在生命的早期呈现典型的运动包括自 主性收缩碰触反应和泳动37。多巴胺能神经元潜 在毒性反应为自发性运动减少_38 25基因抑制技术研究 斑马鱼胚胎己经广泛应
18、用于发育生物学和人 类疾病研究领域 根据斑马鱼生理生殖特点，可方 便地用来生成基因抑制(Knockdown)鱼和转基因 (Transgenic)鱼 目前利用斑马鱼充当模型在该领 域的应用己经取得了一些成果如用GFP来标记基 因功能或MO生成基因抑制斑马鱼 MO靶基因抑 制技术已经用来制备一些基因抑制斑马鱼，比如抑 制Neuropilin一1 fNRPL)的斑马鱼胚胎MO介导的抑 制技术中、通过注射特殊的MO氨基磷酸盐寡核苷 酸到初期胚胎中抑制蛋白质翻译。这些结果从生 理学上第一次证实NRPL是通过一个由血管内皮生 长因子(VEGF)决定的通路调控血管生成。基因抑 制技术的出现为估计体外模型受化
19、合物药理学作 用可能产生的畸形提供了方便。与哺乳动物胚胎研 究相比斑马鱼致畸研究可提供更高的通量。 斑马鱼胚胎技术不仅具有成本低、操作简易、 影响因素少等特点。与成鱼试验相比，其丰富的毒 性指标及较高的灵敏度使其具有更广阔的发展空 间不久的将来极有可能取代并初步判断污水中的 毒性类型及潜在危害程度特别是致畸效应。而解 决各种工业和生活污水所造成的环境问题已经成 为我国环保事业的当务之急因此发展此技术非常 必要而且极有可能在针对污水的综合毒性测定方 面有较大突破从而解决我国目前污水监测和控制 等方面的实际问题 参考文献： f1TON C，LIN YWIU rr CZebrafish as ano
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