1、1IVF 实验室精液操作规程精液样本采集患者取出精液后，直接交给相关实验室人员，不得由第三人转送。实验室人员应做到：1. 询问患者夫妻双方姓名并与精液杯上双方姓名核对。2. 检查精液杯中是否有精液样本，样本是否外泄，颜色是否异常，容器是否破损，容器内是否有明显异物等。如发生异常，应立即询问患者，并采取相应处理措施（如：重新取精） 。上游法分离优选精子一、精液处理前的准备工作： 1将精液处理液（HTF/G-IVF）分装至 5ml 试管内，每份精液样本使用 2 支小管，分别分装 1.5 ml（A 管）和 2.5 ml（B 管）培养液, 放入培养箱预热平衡过。2耗材：巴斯德吸管，5ml 试管，载玻片
2、，盖玻片，橡胶吸头，无菌镊子。一、正常精液：密度20x10 6 /ml，活力 a+b30%的精液样本1. 将精液置于室温 15-20min 液化。2. 将混匀的精液取 1 滴滴于清洁载玻片上于生物显微镜下观察并纪录精液密度、形态、活力等相关数据。3. 精液的收集：在巴斯德吸管和含 1.5ml 培养液的试管（A 管）上填好相应的姓名标签，并在其后的每一步操作之前核对姓名。吸取 1.5ml 精液加入试管中与培养液 1:1 充分混合，如液化不全可多次吹吸至混匀，500g 离心 10min。4. 精液的洗涤：吸弃上清，用一支新的巴斯德吸管从含 2.5ml 培养液的试管中（B 管）吸取 1.5ml 液体
3、加入含精液沉淀的管中。吹吸重悬精液沉淀， 400g 离心 8min。5. 上游：吸弃上清，将试管 B 中剩余的 1ml 培养液吸出，沿含精液沉淀的试管 A 管壁缓慢加入。两管均贴好标签，将试管 A 倾斜 45角放于培养箱中静置 30min。6. 分离优质精子：上游结束后，用巴斯德吸管将试管 A 中的上游液小心吸出，转入试管 B 中混匀，取一滴滴于一载玻片上，压片镜检。报告上游液中精子密度、活力和形态等相关数据，将分离好的精子置于培养箱中待用。7. 分离结束后关闭超净台，整理并丢弃相应污物。精液沉淀须保存至移植日，精液杯盖好后置于物品台上，待当日受精结束后丢弃。二、轻度少弱精：密度 5x106
4、/ml 至 20x106 /ml 之间，活力 a+b:20x10 6/ml, 精子活动率 5% 。4) 畸精症：目前对于畸精症是否作为明确的 ICSI 指征尚有争议。出于安全性考虑，在临床治疗应慎重选择 ICSI，避免过度使用，对精子有微小异常和畸形的夫妇不应采用 ICSI 作为常规治疗方案。对于完全不活动或者顶体缺乏（圆头）的精子，必须采用 ICSI 的方式受精。完全不活动的精子可以通过低渗等途径挑选存活精子进行单精子注射。除了原始的精液数据外，在 IVF 治疗中采用何种授精方式也要着重参考精液处理后所获得的总活动精子数。在考虑是否采用 ICSI 受精时要结合精液密度、活力、形态和相关功能检
5、查及女方生育史，IVF 史等因素综合考虑，尽量严格把握 ICSI 指征，如果能够采用常规 IVF 方式，不应该扩大 ICSI 指征。2既往 IVF 受精失败史或 IVF 低受精率史 (正常受精率 20%)常规 IVF 受精失败的原因有多种，为了预防再次发生受精失败，在新的治疗周期中倾向采用 ICSI 受精。但是 ICSI 替代常规 IVF 不一定能避免受精失败或低受精率的发生在确定新的方案时应详细分析前一次失败原因。3不明原因不孕不明原因不孕的患者，如果多次 IUI 未孕，在改行 IVF 方案治疗时如果获卵数12，可采用 RT 和 ICSI 受精各半的方式。4梗阻性无精子症5生精功能障碍6IV
6、M7解冻卵母细胞8解冻精子活力弱 9污染史10免疫性不孕综上所述，考虑到 ICSI 安全性和潜在风险，在临床治疗中应当严格保守的选用 ICSI 方4案，除了参考精液原始的密度、活力或形态的参数外，还要结合精液处理后获得的总活动精子数目以及夫妻双方的病史等因素综合考虑以确定合适的受精方式。常规精液冻存的指征：1 手淫取精极度困难：尤其是前次 IVF 助孕时因手淫取精失败最终行 TESA 取精的患者。2 取卵日男方因特殊原因不能到医院取精的患者。3 等待赠卵的患者。备注：乙肝、丙肝、梅毒等传染性疾病患者不予冻存精液。5精子冷冻1 常规精子冷冻1 精液取出后，于 37恒温台液化完全，同时取出 1ml
7、 已预分装好的精子冷冻液（WEN）于恒温台上解冻并使其恢复至室温。2 镜检，取一滴精液压片，于生物显微镜下镜检，方法同常规精液镜检，报告原始精液质量，记录于精液处理单上。3 确认精液适合冻存后，与患者谈话并签写精子冻存协议书 。本实验室留去第一联与该病人取精单装订。在精液冷冻登记本上记录：夫妻姓名，冷冻日期，精液质量，冷冻编号，冷冻位置等。4 待冷冻液恢复至室温后，取一支干净巴斯特吸管，贴标签，吸取 1ml 精液与冷冻液充分混合，分装至 3 支干净的冷冻管中。用 Maker 笔在每支冷冻管上标记夫妻双方姓名、冷冻日期、冷冻号。室温静置 10min。5 选择冷冻位置，制作冷冻管支架。根据液氮罐中
8、的空余位置，选择合适位置存放冷冻精液，根据选定位置给铝制冷冻管支架编号，将冷冻管固定于冷冻支架上。6 室温静置 10min 后，将冷冻支架转移植 4冰箱，静置 20min。同时制作液氮蒸汽吊桶。取一金属吊桶悬吊于液氮液面上（预冷 10min）从 4冰箱转出标本后置于-20冰箱静置 3min。7 将冷冻支架从冰箱中取出，迅速（5s 内）放至金属吊桶内，静置 6min。8 将支架从液氮蒸汽吊桶内取出，迅速放至液氮罐的相应位置上。9 将液氮罐关好并检查确认。10 结束，收拾工具，丢弃废弃精液样本及使用过的试管、吸管、精液杯等物品。11 解冻一管精液样本，确定冷冻是否成功，若解冻后无活动精子则应废弃该
9、批冷冻样本，通知患者重新取精冷冻，并以其他正常精液样本作对照实验，以确认精子冷冻液无问题。如解冻后精子活力正常，则无须通知患者。2 TESA/PESA 精子冷冻1 同 TESA/PESA 精子处理步骤1。2 取一干净巴斯特吸管，将 TESA/PESA 检查认为有冻存价值的睾丸组织或附睾穿刺液收集至一干净圆底试管中，贴标签，600G 离心 10min。(离心同时，取一支已分装好冷冻液的冷冻管（10d/管） ，一支干净冷冻管，用 Maker 笔分别标记夫妻姓名，冷冻日期，冷冻号。并将其置于恒温台，使其恢复至室温。与患者夫妇谈话，签写精子冷冻协议书 。 ）3 离心后吸去上清液，另取一支巴斯特吸管吸取少量培养液，向试管中滴加10d，充分混匀后加入含冷冻保护剂冷冻管中，与冷冻液充分混匀。取 10d 分装6至另一冷冻管中，拧紧冷冻管盖。室温静置 10min。4 室温静置 10min 后，将冷冻支架转移植 4冰箱，静置 15min。同时制作液氮蒸汽吊桶。5 将冷冻支架从冰箱中取出，迅速放至金属吊桶内，静置 15min。6 将支架从液氮蒸汽吊桶内取出，迅速放至液氮罐的相应位置上。
