1、结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）制造及检定规程本品系用结核杆菌经液体表面培养、蒸汽杀菌过滤除去菌体，用沉淀分离、洗涤及再溶解的提纯方法制成的液体或冻干制品，含有从结核杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是蛋白质，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的机体，能引起特异的皮肤变态反应。用于检查结核杆菌的感染及观察免疫反应。1 菌种1.1 菌种由中国药品生物肉制品检定所分发或经同意。1.2 制造 TB-PPD 用人型结核杆菌，菌号 93009（H37Rv）。菌种应有完整的历史资料，经过全面检定，冻干保存。1.3 应制备生产用菌种批，次级菌种批应控制在 5 代以内。2 制造全部生产过程，包括杀死
2、分枝杆菌，应在完全隔离的区域内用专用设备进行。2.1 制造用培养基使用苏通马铃薯培养基，改良苏通综合培养基，或其他适宜培养基。培养基中应不含已知能对人或动物造成毒性和变态性反应的成分。2.2 启开菌种（菌种批）反接种于苏通马铃薯培养基上。置 37培养 23 周，可在苏通马铃薯培养基上再传一代或直接挑取苏通马铃薯管内生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置 37静止培养 12周，供大量接种用。2.3 大量接种挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他适宜培养基的表面，置37静止培育 810 周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。
3、2.4 杀菌培养终止，将培养物加热，12130 分钟进行杀菌处理。2.5 除菌杀菌后用滤器除去菌膜及菌体，收集滤液并取样做无菌试验，然后，加入 0.3%苯酚或其他适宜的防腐剂。滤液保存在 48，但要防止冻结。2.6 提纯用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白，加压过滤除去清液，并收集沉淀物于 3m 孔径的滤膜上，然后用 10%氯化钠液洗酸脱盐至中性为止，最后以磷酸盐缓冲液将沉淀物溶解，除菌过滤后即为原液。亦可采用其他适宜方法提纯。2.7 分批每次提纯的原液作为 1 亚批。最多将 5 个亚批混合组成为 1 批。2.8 半成品检定2.8.1 物理检查原液应为深棕色的澄明液体，不应有沉淀物或其他杂质。
4、2.8.2 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.8.3 安全试验用体重 300400g 健康豚鼠 2 只，每只腹腔注射原液 1.0ml，观察 6 周，检查其症征或死亡。所有在试验后 24 小时内死亡的或表现出症征的动物应作镜检，然后将有关的组织镜检和培养，检查其有无分枝杆菌存在的证据。观察期中活存的动物也要以同样方法检查。如果分析杆菌活菌培养试验阴性，在观察期中全部豚鼠健康存活，无一动物出现分枝杆菌的症征，则可判定浓缩原液通过试验。如果未到观察期，任何动物死于非结核病因，本试验可复试一次。2.8.4 致敏效应试验实验组与对照组分别用体重 300400g 未做过任何试验的健康豚鼠各 3 只，
5、实验组每只豚鼠皮内注射 0.1ml 含 500IUTBPPD 样品，共 3 次，每次间隔 5 天，在第 3 次注射后 15 天，实验组与对照组每只豚鼠各皮内注射 0.1ml 含500IUTBPPD 样品，连续观察 3 天，两组动物反应不应有明显区别。2.8.5 纯度测定应测定蛋白（凯氏定氮法）、多糖（蒽酮法）与核酸（紫外分光光度法）含量。蛋白含量应90%，多糖含量3%。2.8.6 效价测定TBPPD 标准品由中国药品生物制品检定所提供。2.8.6.1 动物试验将标准品及待检原液分别稀释马 0.1ml 含 100IU、20IU 及 4IU 或其他适宜的稀释度，用体重 400600g 已致敏的白色
6、雌性豚鼠最少 4 只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度各 0.1ml（从尾侧起先注射稀释度最高者）。于注射后 24、48 小时各观察结果 1 次（可根据 48 小时的反应结果判定），算出待检和标准 TB-PPD 的平均硬结反应（纵横直径相加除 2）计算累计值，并求其比值，比值 10.2 者为合格。也可按 WHO 规程要求，标准品及待检样品分别稀释 3 个不同的适宜稀释度，用6 只致敏豚鼠，以轮圈法注射于豚鼠背部两则，每侧 3 点，每点皮内注射 0.1或 0.2ml 样品，用双盲法分别记录 24 及 48 小时局部硬结的纵径与横径。计算每个稀释度 2 天的总和（也可计算 2
7、天的平均面积），并求其比值，比值 10.2者为合格。稀释度的选择应能使注射后 24 小时所产生的局部硬结反应直径不小于 8mm，不大于 25mm，两个样品的反应直径大致相同及两个样品的 3 个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。如待检样品效价与标准品效价不一致，可用同样方法重试一次，并算出相当于标准品的效价进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至合格。2.8.6.2 人体反应测定动物试验合格后，应进行小量人体测定，选择对 TBPPD1IU（好 0.02g 结核蛋白）反应阳性的敏感成人最少 5 人或者皮内接种卡介苗 12 周后免疫效果观察的婴幼儿至少 20 人，每人于两前臂内侧相对部位分别注射 5
8、IU 的标准品与待检样品各 0.1ml，注射后 72 小时观察结果，并求其比值（计算方法与 2.8.6.1 项相同）。比值 10.2，并无 1 例异常反应者为合格。2.9 分装冻干经物理检查、无菌试验、安全试验、致敏效应试验、蛋白质含量及效价测定合格后，即可根据蛋白质含量将原液进行定量稀释至规定浓度，然后定量分装安瓿，每安瓿装量为 0.5ml，分装后立即进行冻干。每安瓿的分装误差应符合标准品的要求（差异系数不超过 1%）。冻干后抽样做成品检定，亦可将原液保存备用。3 浓缩物检定3.1 物理检查冻干 TBPPD 应为白色疏松体，无融化迹象。加入稀释液后，应于 3 分钟内全部溶解，呈棕黄色澄明液体
9、，不得有不容物或杂质。如系液体原液，亦应为棕黄色澄明液体，不应有不溶物或杂质。3.2 水分测定冻干制品水分含量应3%。3.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.4 安全试验按 2.8.3 项进行。3.5 纯度测定按 2.8.5 项进行。3.6 致敏效应试验按 2.8.4 项进行。3.7 效价测定动物试验按 2.8.6.1 项进行。人体反应测定按 2.8.6.2 项进行。但观察人数需增加 12 倍。3.8 保存与效期保存于 28冷暗处。冻干制品自效价测定合格之日起效期为 10 年。液体原液自效价测定合格之日起效期为 5 年。4 TBPPD 和稀释4.1 稀释经检定合格的浓缩物用内含 0.0
10、005%吐温 80 及 0.3%苯酚的 pH7.27.4 的0.01mol 的磷酸盐缓冲生理盐水稀释至 20IU 或 50IU。各处稀释用具应专用。加入 TBPPD 后应充分摇匀，并逐瓶抽样作无菌试验，合格后分装。4.2 分批每次稀释的同一浓度的稀释 TBPPD 为一批，同时有数瓶者，按瓶分为亚批。4.3 分装由专人用专用工具进行。5 成品检定5.1 物理检查分装后应进行破漏、装量、外观检查。应为无色澄明液体，不得有不容物或杂质。5.2 化学检查pH 值应为 6.87.4。苯酚含量应为 0.25%0.5%。5.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。5.4 防腐剂试验用体重 1820g 小白鼠
11、 2 只，各皮下注射样品 0.5ml，小白鼠震颤时间不得超过半小时，观察 7 天，不得有局部脓肿或死亡。5.5 安全试验每批用体重 1820g 小白鼠 5 只，各腹腔注射样品 0.5ml，观察 1 周，小白鼠应健康活存。5.6 效价测定按 2.8.6.1 项进行。比值 10.2 者为合格。6 保存与效期保存于 28暗处。自稀释检定合格之日起效期为 1 年。50IU/ml 结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）使用说明书本品为每 ml 含 50IU 结核菌素纯蛋白衍化物（TBPPD）的稀释制剂，经与国家标准品标准，达到完全一致。专供结核病的临床诊断，卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后质量监测用。本
12、品为无色澄明液体，含苯酚防腐剂，不得有不溶物或杂质。对象婴儿、儿童及成人均可使用。用法吸取上述稀释液 0.1ml（5IU），采取孟都氏法注射于前臂掌侧皮内，于注射后4872 小时检查注射部位反应。测量应以硬结的横径及其垂直径的 mm 数记录之。反应平均直径5mm 为阳性反应。凡有水泡、坏死、淋巴管炎者均属强阳性反应，应详细注明。禁忌患急性传染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等），急性眼结合摸炎，急性中耳炎，广泛性皮肤病者暂不宜使用。注射事项1.注射器及针头应当专用，不可作任何其他注射之用。2.安瓿有裂纹、制品内有异物者不可使用。保存本品为已稀释制品，于 28保存，效期为 1 年。20IU/
13、ml 结核菌素纯蛋白衍化物（TBPPD）使用说明书（专供流行病学调查用）本品为每 ml 含 20IU 结核菌素纯蛋白衍化物（TBPPD）的稀释制剂，经与国家标准品及 PPDPT23 标化，达到完全一致。专供结核病流行病学调查及临床疑似结核病人诊断用。本品为无色澄明液体，含苯酚防腐剂，不得有不溶物或杂质。用法吸取上述稀释液 0.1ml（2IU），采取孟都氏法注射于前臂掌侧皮内，于注射后4872 小时检查注射部位反应。测量应以硬结的横径及其垂直径的 mm 数记录之，反应平均直径6mm 为阳性反应。凡有水泡（包括微小水泡）、坏死、淋巴管炎者均属强阳性反应，应详细注明。反应判定及处理凡强阳性及硬结直径20mm，或 3 岁以内未接种过卡介苗的儿童（根据接种史和检查局部卡痕确定），结素反应阳性者，即使胞部透视正常，仍需按活动性结核处理，并建议予以内服异烟肼半年至 1 年。禁忌患急性传染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等）、急性眼结合膜炎、急性中耳炎、广泛性皮肤病者暂不宜使用。注意事项1.注射器及针头应当专用，不可作任何其他注射之用。2.安瓿有裂纹、制品内有异物者不可使用。保存本品为已稀释制品，于 28保存，效期为 1 年。
