1、特殊生物显微镜的原理与使用,兰州大学细胞生物学研究所,主要内容,暗视野显微镜 相差显微镜 偏光显微镜 微分干涉显微镜 荧光显微镜 激光共焦扫描显微镜,1 暗视野显微镜,根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜 观察到明场看不到的极其微小的物体 最高分辨率可达0.004微米,1.1 原理丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。1.2 结构特点使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标
2、本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。,暗场显微镜原理,1.3成像特点及优缺点在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于12波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。,1.4 应用：微小粒子、细菌形态、
3、细菌记数，透明标本观察等。 1.5 暗场显微镜的要求 要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘 物镜前透镜必须清洁无尘 载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求,1.6暗场观察方式调节 (1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。 (2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。 (3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。,2 相差显微镜,2.1 原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间
4、上光的波动所能达到的位置)的不同。 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。,相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 2.2结构特点 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状
5、光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。,相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。 调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合），才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显
6、微镜的作用。,2.3使用方法 （1）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 （2）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。,（3）合铀调整拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；
7、一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。（4）观察 换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。,2.4用途用于观察组织培养中活细胞形态结构。活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。,偏光显微镜,依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜 分辨率可达0.04微米 将普通光改变为
8、偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性),一、偏振光与自然光 1. 横波的偏振性 光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内, 可有不同的振动方向。,只有横波才有偏振现象,2.线偏振光-光矢量只在某一固定的方向上振动。,3.自然光 普通光源发出的光,在垂直于传播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E 的振幅都相等。,二、起偏和检偏 起偏：使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。 检偏：检查入射光的偏振性的过程。 双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。尼科耳棱镜。在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒
9、、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。,寻常光线(o光):遵守折射定律。对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。 非常光线(e光):不遵守折射定律。它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播 。 o光和e光都是线偏振光,且振动方向相互垂直,二向色性：某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。 旋光现象：线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度 的现象，称为旋光现象。这种介质
10、称为旋光物质。如石英、糖、酒石酸钾钠等。,偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化,偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化,.,起偏器,检偏器,自然光,线偏振光,.,.,.,.,偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化,.,起偏器,检偏器,自然光,线偏振光,偏振光经过旋转的检偏器后光强发生变化,.,起偏器,检偏器,自然光,线偏振光,尼科尔棱镜,用途 用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质,微分干涉显微镜,无色透明活体标本的细微结构 图象呈浮雕状的立体感 观察效果更加逼真,1 原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别
11、，使图象呈现出立体三维感觉。 2 特点 可以使被检物体产生三维立体感觉 观察效果更直观 无须特殊物镜，与荧光观察配合更好 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。,荧光显微镜,一、原理荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础
12、上组成的。,什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发光化荧光,荧光的种类：自发荧光（固有荧光）二次荧光,荧光的性质：吸收光，必需有激发光源荧光波长激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,二、荧光显微镜的种类：透射式落射式,荧光显微镜,三、荧光显微镜主要部件,透射式汞灯光源 激发滤色镜 吸收滤色镜 暗场聚光镜 物镜,落射式汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 物镜,荧光显微镜内部构造,落射荧光显微
13、镜光路图,透射荧光显微镜光路图,落射式荧光显微镜优点,由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。,超高压汞灯,荧光光源 一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他
14、光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。,荧光滤色片组,紫外光（UV）：激发光谱区域：330-400nm； 可见荧光起绐光谱：425nm 紫 光 （V）：激发光区域：395-415nm； 可见荧光起绐光谱：455nm 蓝 光 （B）：激发光谱区域：420-485nm； 可见荧光起绐光谱：515nm 绿 光 （G）：激发光谱区域：4
15、60-550nm； 可见荧光起绐光谱：590nm,荧光专用物镜,FL25X/0.65 FL40X/1.0（甘油） FL100X/1.25（甘油）,荧光染料：,核 酸：溴化乙锭、吖啶橙、PI、DAPI等。 细胞骨架：鬼笔环肽。 蛋 白：抗原抗体免疫荧光 各种荧光蛋白（GFP、YFP等）,四、使用方法1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。3放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引
16、起眼的损伤；,4高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。,五、用途1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。,3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙
17、可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。,WU,WIB,DUAL BAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,双重染色标本的单色和双色观察,激光扫描共焦显微镜技术,介绍：激光扫描显微镜是建立在光学显微镜及各种扫描显微镜基础上的一种新型的扫描成象系统。采用激光作为光源，使用激光扫描装置和共轭聚焦装置，利用聚焦的激光束在样品表面扫描，同时利用光电检测器件接收样品反射光（或透射光），样品结构的变化使反射光
18、（或透射光）强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经信号处理，同步显示在计算机屏幕上。,激光,物镜,标本,共聚焦针孔 (Pinhole),光电倍增管 (PMT),荧光滤光片 (发射光滤色片),共聚焦原理,扫描？,X线上的荧光强度变化,OLYMPUS,65,X,Y,扫描显微镜,Z,显示器,标本,标本,PMT,PC,为什么用PMT（光电倍增管）？,相比CCD，PMT拥有更高的感光效率 更快的读出速度（微秒级） PMT采集时间信息电脑还原为位置信息,共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 3. 增加侧向分辨率 4. 由于点
19、对点扫描去除了杂散光的影响,宽场照明显微镜和共聚焦图像比较,激光扫描共焦显微镜的设计特点: 1.点照明，激光光源2.具有照明小孔和探测小孔 3.照明小孔和探测小孔共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4.具有扫描系统逐点扫描成像 5.无损伤、连续光学切片，显微“CT” 6.真正的三维重组 7.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物,激光共聚焦显微镜的组成,激光共聚焦显微镜一般由 激光光源，显微镜和成像系统三部分组成,激光光源,Laser lines （Cofocal)405, 442, 457, 477, 488, 514, 543, 568, 637 n
20、m,例如：蓝光激光二极管,405nm excitation. HQ442/45 emission filter (DAPI) Applications e.g. DAPI, Hoechst CFP Pacific Blue others,氦-氖激光( HeNe laser ) 543 nm ,633 nm,氩激光( Ar laser) 458, 477, 488, 514 ,568nm,显微镜,Upright Microscopes Nikon E600 Nikon E800 Nikon E1000 Nikon Optiphot 2Zeiss Axioplan 2 Zeiss Axioskop
21、 Olympus BX50/51 Olympus BX50WI Olympus BX60 Olympus BH2Inverted Microscopes Nikon TE2000 , TE300 Nikon Diaphot 300 Zeiss Axiovert 200 and TV Zeiss Axiotech Olympus IX70 and TVR,激光共聚焦显微镜在生物学中的应用,。,组织光学切片,三维图像重建,Cy2-anti- basement membrane proteinCy3 anti- neuronal processesCy5 anti-blood vessel prot
22、ein.,多荧光标记分析,动物细胞间的胞间通讯研究,植物细胞间的胞间通讯研究,植物细胞中胞间连丝相关蛋白Rab11的定位,A confocal image of a 6-day-old zebra fish (dorsal view) embryo that has been double-labeled with antibodies against cell adhesion molecules shows staining of different subpopulations of axons in the nervous system Photonic Solutions for B
23、iotechnology and Medicine November 2002,活体状态下细胞的动态变化,拟南芥侧根顶端分生细胞的分裂,活细胞延时实验：,根据激光发生器的不同，目前可分为单光子激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning Microscopy ）、双光子激光扫描显微镜( two-photon excitation Microscopy)和多光子激光共聚焦显微镜（ Multi-photon Microscopy）。,two-photon excitation (TPE) Microscopy,双光子激光扫描显微镜 双光子激光扫描显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微
24、镜和双光子激发技术的一种新技术。,双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的激发态寿命后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个 12波长的光子的单光子激发相同。,Multi-photon uses long wavelengthlight (red or infra-red) to excite fluorescence.,双光子激光扫描显微镜的激光,常用钛-蓝宝石激光（Titanium Sapphire） 700 - 1000nm (tuneable)100 femtosecond pulse width80 MHertz
25、pulse repetition rate双光子显微镜使用高能量脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。,双光子荧光显微镜有很多优点： 1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本； 2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本； 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小； 4）使用双光子显微镜观察标本的时侯，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性等，所以双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本和活细胞及进行定点光漂白实验。,穿透深度大,皮肤组织中NADH自荧光成像,光毒性、光漂白小,单光子激发产生的漂白效应,双光子激发产生 的漂白效应,
