1、第三章 物理图绘制,用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序 阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性： 遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。 遗传图的覆盖面较低：重组热点、极少重组区段的存在。 遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。,物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。,1）限制性作图（Restriction mapping）： 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）基于克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) ：根据克隆的DNA片段之
2、间的重叠顺序构建重叠群 (Contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）： 将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。 4）序列标签位点作图 （Sequence tagged site, STS）：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。,物理图绘制方法,3.1 限制性作图,限制性内切酶： 型限制性内切酶：催化宿主DNA甲基化，在识别位点约1000bp以外任何位置切割DNA链，不产生确定限制片段和明确条带 型限制性内切酶：在识别位点之中或邻近的确定碱基位置特异性切开DNA链
3、，产生确定的限制性片段和条带，是3类限制性内切酶中唯一可用于限制性作图的酶 型限制性内切酶：催化宿主DNA甲基化，在识别位点约25-27bp何位置切割DNA链，要求识别位点是反向重复序列，很少产生完全酶切的片段,3.1.1 限制性作图的基本方法,比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。 首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。 然后用第二种酶处理，获得第二组片段。 最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。 收集上述资料进行对比组装。 两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。 连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法（多个相同酶切位点区段只发生一
4、次酶切）。 切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。,3 Physical mapping 3.2 限制酶作图,限制酶作图的基本方法,8,结论：图谱II是正确的,双限制性酶切图解,片段 结论,0.2kb,0.5kb 必然来自0.7kb的BamHI片段，其中有一个EcoRI的位点,1.0kb 这必然是一个不含EcoRI位点的BamHI片段，如果我们如下放置1.0kb的片段，就可以解释1.5kbEcoRI片段的出现,1.2kb,2.0kb 这必然也是不含EcoRI位点的BamHI片段，它们必须位于3.4kb的EcoRI片段中。这样就有两种可能：,BamHI部分限制性酶切的预测 如果图
5、谱I是正确的，不完全消化产物应该包括1.2+0.7=1.9kb的片段 如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括2.0+0.7=2.7kb的片段,BamHI亚适条件,限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子。 实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。 一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可见的，我们利用可见的部分大小，确定那些
6、未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。,末端同位素标记（或其他标记）结合部分酶切：形成梯形分布带,3.1.2 限制性作图的局限,如果基因组较大，切点较多，单、双、部分 酶切的片段会很多。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子。 通过选择靶DNA分子中的稀有酶切位点酶可以克服限制性酶切作图的局限性。 稀有切点限制酶: 在基因组DNA顺序中只有很少可识别序列的限制酶, 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有高G/C比。 稀有切点限制酶分为两大类： 识别具有7或8个核苷酸序列的酶； 识别序列包含靶DNA稀少基序的酶。,稀有切点限制图绘制,识别顺序越长产生的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片
7、段长度小于预期； 识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般A/T比较高, 应选G/C 高比例限制酶, 如-GC GGCCGC-(NotI) 限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组； 基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组DNA甲基化比例很高, 但果蝇和酵母基因组无甲基化。,稀有切点限制酶,选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA 预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小,1) 根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNA片段长段:NotI 酶: GC/GGCCGC48=74 536 bp=75 k
8、bI-SceI 酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90 000 000 bp=90 000 kb 2) 由于多细胞真核生物基因组DNA存在大量的甲基化位点, 识别CG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNA片段比预期大得多.如NotI酶切人类基因组DNA产生的片段常在200 kb以上，平均长度达到1Mb。,PFGE的基本原理将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb。 常规琼脂糖凝胶电泳可分辨30kb以下的线性分子，脉冲凝胶电泳可分辨10Mb的
9、大分子,大片段DNA的分离技术脉冲凝胶电泳,常规与非常规琼脂糖凝胶电泳,正交变电场凝胶电泳 3.脉冲凝胶电泳,垂直交变电场电泳,垂直交变电场(OFAGE)，有2对电极，分别位于凝胶对角线的两端，2对电极轮流接通电场，产生一个交替的方向不同的电场，DNA分子在凝胶中不断改变迁移方向。交变电场电泳主要用于相对分子量较大的DNA分子的分离。,均一脉冲电泳,大肠杆菌基因组物理图,3.2 基于克隆的基因组作图 -大分子DNA的克隆,基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA 片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)， 绘制物理连锁图。,3.2.1 载体 质粒、噬菌体、粘粒 啤酒酵母基因组主要是先构建粘粒
10、文库，然后建立克隆重叠群完成测序 高等生物基因组 拟南芥1.2X105bp，需要25000个克隆 人类基因组是拟南芥基因组的33倍,3.2.1 大分子DNA克隆载体,常规的质粒载体不适用于大分子DNA的克隆。 大分子DNA克隆载体构建:YAC, BAC, PAC,酵 母 人 工 染 色 体（YAC）,端粒：用于保护线状的 DNA 不被细胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。
11、,端粒,YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达1Mb以上。,YAC 载体的工作原理,YAC的主要缺点： 1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段； 2部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排； 3难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构; 4转化效率低。,噬菌体P1载体：与载体相似，将天然噬菌体基因组中的一段区域缺失，容量达125kb 细菌人工染色体BAC：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合 P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优点,细菌人工染色体（BA
12、C）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。 选择标记： 氯霉素抗性基因等。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象； 转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取； BAC文库筛选方便。,载体的种类和特征,基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切 酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的 同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体 代表了某种有机体整个基因组。1) 目标基因组大分子DNA的制备；2) 载体制备；3) 载体和DNA的连接；4) 转化；5) 转化子鉴定。,YAC和BAC基因组文库的构建,目标基因组大分子DNA的制备,
13、样品洗涤吸干水分液氮冷冻碾碎离心收集细胞核低融点琼脂糖包埋蛋白酶消化洗涤限制酶部分酶解,插入大分子DNA的分离,载体制备与插入DNA连接,1) YAC载体：制备过程与一般质粒载体相同。 2) BAC载体：低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。 3) 酶切：释放接头，接头去磷，减少自连。 4) 连接：将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合, 按重量比1:1，680C保温 5 min，降温至370C，加入连接酶过夜。,染色体步移,3.2.2 重叠群组建,相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。,构建重叠群：步移法和指纹法,3.2.3 指纹作图3种指纹,在基因组范围内查找重叠的克隆
14、，最好的方法是克隆指纹排序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段，两个片段相邻排列。,指纹作图 限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠 重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明重叠 STS目录作图：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增,限 制 性 片 段 指 纹 作 图 原 理,
15、限制性片段指纹电泳图,指纹重叠群构建,酵母基因组遗传图与物理图的整合,3.3 原位染色体连锁图,原位染色体连锁图：通过原位杂交的方法将基因或DNA 分子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图称为原位染色体连锁图。 最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。（fluorescent in situ hybridization , FISH） 原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法，其必须使染色体DNA 成为单链。,荧光原位杂交,原位杂交的操作染色体分裂细胞 染色体变性 检测信号早期的原位杂交用的标记是放射性标记，但放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率两个原位杂交的必要条
16、件。 20世纪80年代发展起来的荧光标记解决了这一矛盾。 为了得到高灵敏度，探针的标记量要尽可能大一些，以往的探针至少40kb。现在由于强信号荧光物质的发现和重标记技术的发明，对探针长度的要求已经不那么严格了。,甲酰胺处理,加入探针,一种封闭杂交探针中重复序列的方法,如何提高荧光原位杂交的分辨率？,原位杂交的分辨率与染色体的制备有关： 中期染色体：过于收缩，其分辨率1000kb，主要用于发现新的分子标记属于哪条染色体； 机械伸展的中期染色体：离心可使中期染色体伸张，保持形态，提高分辨率200300kb； 非中期染色体：松弛状态，分辨率可达到25kb以下，用于小区段分子标记排序研究。,限制性作图
17、不能用于大型基因组；克隆重叠群复杂，费时费力；FISH难于操作，数据积累慢。 目前最有效的物理作图技术，也是能对大型基因 组产生最详尽图谱的技术，是STS作图，主要为 辐射杂种作图。,3.4 辐射杂种作图,序列标记位点(STS)是一段短的DNA序列，其长度通常为100500bp。一段DNA序列要成为STS需满足两个条件： 1.它的序列必须是已知的，便于PCR检测； 2. STS必须在拟研究的染色体上有唯一的定位。,寻找STS的方法: 1）从EST序列中寻找：来自cDNA， EST来自单拷贝的基因时可作为STS 2）SSLP：具有多态性并已在连锁分析中定位随机基因组序列 3）随机基因组序列：在数
18、据库中寻找所感兴趣的某些序列,3.4.1 序列标记位点,STS作图原理,两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大。 两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根据它们的分离频率来算。,STS作图原理图示(1),STS作图与连锁分析是一样的，不同之处仅在于两个标记间的图距是根据分离频率来计算的。 主要采用的方法是辐射杂种作图。,辐射杂种（放射杂交体）：指含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞。 辐射杂种群（radiation hybrid panel)：通过放射杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群。 辐
19、射杂种群分为两类： 全基因组辐射杂种群 单染色体辐射杂种群,3.4.2辐射杂种作图的程序与方法,全基因组辐射杂种的筛选,并非所有参与融合的鼠类细胞都会保留来自人类的染色体片段，因此要对其进行鉴别: 使用不能产生胸腺激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长。,Z之后，可通过PCR 检测STS标记，根据成对STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度,单染色体辐射杂种群,构建：用x射线照射另外一类含一条人染色体的啮齿类（如小鼠）
20、细胞系，再将这种细胞与仓鼠细胞融合。筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如Alu（一类SINE)做探针，筛选只含有人染色体片段的杂种细胞。,辐射杂种图距单位,辐射杂种的作图单位为厘镭(centiRay, cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad) X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率。,利用类似于遗传重组原理和最大似然性的统计学方法来计算存在于DNA片段上的STS之间的断点频率，以此估计标记之间的距离。,人类21号染色体辐射杂种图,人类21号染色体辐射杂种物理图,探针,探针排列次序，以及相邻一对探针之间的图距,3.5 遗 传 图 物 理 图 的 整 合,酿酒酵母chr3遗传图与物理图的
21、比较,因为分子标记在染色体上的位置是特定的，可以通过分子标记将遗传图和物理图联系起来，通过比对查找错误，并重新验证。,人类基因组物理图谱:人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个。再从中筛选出3万个EST、2个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、1个有32000个克隆的YAC文库，用于构建物理图谱。构建物理图谱的密度为每个标记183Kb。EST分布结果表明，基因在染色体上的排列是不均匀的。将物理图谱和遗传图谱整合而成更加完整的人类基因组图谱，作为基因组测序的框架和分析的依据。,1）1987年，发表遗传图，含403个标记，密度为1
22、0Mb； 2) 1994年,发表遗传图, 含5 800个标记, 密度为0.7 Mb. 3) 1993年，发表重叠群物理图，含33000个YAC; 4) 1995年, 发表STS图, 含15 086 个标记, 密度为199 kb. 5) 1996年,发表遗传图, 含7050个标记, 密度为600kb. 6) 1996年, 发表物理图, 含17 096 个标记, 密 度达 100 kb. 7) STS图中含 7 000多个SSLP, 使遗传图与物理图彼此衔接, 成为测序的框架图.,人类基因组图,图谱的应用-定位克隆（图位克隆）,定位克隆（positional cloning）：利用遗传连锁或细胞学
23、定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带并对目的基因进行克隆。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特定染色体上。A-1型短指（趾）症：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了这一病症，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的经典例子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。,贺林等利用布依族、苗族和汉族的三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并
24、首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。,番茄抗病基因的图位克隆,定位候选克隆,该方法是定位克隆的进一步发展。 将疾病相关基因定位于染色体相关区域； 该染色体区域得到若干候选基因； 进一步分析得到目的cDNA； 蛋白质功能研究。,疾病,染色体定位,若干候选基因,确定目的基因,蛋白质功能,功能克隆,克隆（致病）基因的另一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。,性状（疾病）,蛋白质产物（生物学功能）,从氨基酸序列出发设计 DNA引物，从文库调取基因,得到基因序列,染色体定位,疾病,功能,基因,分析异常基因的
25、产物（蛋白质），弄清它是如 何引起临床症状的：纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此 推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针， 然后用探针从cDNA文库或基因组文库中筛选对 应的编码基因；绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷病如白 化病（albinism）、苯丙酮尿症（PKU）和镰刀形 细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采 取的这一策略。,流式细胞仪计数仪 荧光染料对染色体染色。 荧光探测器确定含有正确染色体的液滴发出的信号，并将一个电荷加到液滴上,Science：发现新抑癌基因SDH5 郝淮湘博士从一个功能未知的蛋白入手，发现了一个疾病基因并阐明了其分子功能和致病机理。,S
26、DH5, a Gene Required for Flavination of Succinate Dehydrogenase, Is Mutated in Paraganglioma Huai-Xiang Hao 1, Oleh Khalimonchuk 2, Margit Schraders 3, Noah Dephoure 4, Jean-Pierre Bayley 5, Henricus Kunst 6, Peter Devilee 7, Cor W. R. J. Cremers 6, Joshua D. Schiffman 8, Brandon G. Bentz 9, Steven
27、P. Gygi 4, Dennis R. Winge 2, Hannie Kremer 3, Jared Rutter 1*,郝淮湘，一位在美国诺华生物医学研究所接受博后训练的80后大男孩，在Science上发表了一篇漂亮的研究性文章，文章被同期的Nature杂志推荐为亮点研究成果。,郝淮湘 19992003年在厦门大学生命科学学院生物科学专业就读，最后一年在长江学者林圣彩教授实验室完成了本科毕业论文。 2003年8月来到美国犹他州盐湖城的犹他大学就读，次年加入医学院生物化学系的Jared Rutter教授实验室，在其指导下进行博士论文研究，2009年5月答辩。 2009年6月至今，在波士顿剑
28、桥的诺华生物医学研究所（Novartis Institutes for BioMedical Research）进行博士后训练。,生物通：作为一名80后的年轻人，您可以说十分年轻，就已经获得生命科学领域的博士学位，能谈谈您出国求学的成长历程吗？可以给我们的青年读者介绍一下在美国学习的感受吗？ 郝淮湘：其实我拿到博士学位并不算早，花了将近六年（20032009），有人四年多就博士毕业了。来美国后第一年主要是上课和在四个实验室轮转（可以从将近100个实验室选择）。这边上课没有教科书，一门课多个教授授课，很多时候都是直接讲文献，一个部分上完就考一次试，记忆的东西不多，主要是分析能力。第二年的时候，我
29、根据自己的兴趣和对导师和课题的判断加入了一个新成立的实验室，跟年轻导师做研究虽然会辛苦一点，但是的确能学很多东西，也有机会了解如何建立实验室和从头构思课题。在此后的5年里，我接触了多个研究项目，一些失败了，最后有两个得以发表，并顺利毕业。总体而言，我觉得美国的博士教育制度还是比较有效的。,生物通：在Science上发表文章很不容易，除了英语要过关外，您还有什么忠告给读者吗？ 郝淮湘：英语的确很重要，但不是最重要的，只要意思表达清楚就可以了，文章接受后编辑会帮助修改的。我觉得最重要的是课题的创新性和意义，所以设计课题的时候就应该多考虑这两个方面，把研究的起点抬高。最后写文章的时候，也要尽可能突出
30、这两方面，尤其是在投稿的说明信（cover letter）和文章的摘要里。,生物通：在您的研究过程中，遇到最大的难题是什么？您是如何克服的？ 郝淮湘：曾经有一段时间，SDH5课题无法进行下去，因为抑制子筛选（suppressor screen）只能找到SDH5本身，而标记的Sdh5蛋白又不溶，不能开展生化研究。我测试了至少十种去垢剂(detergent)和不同的浓度，效果并不好，后来偶然发现如果使用提纯的线粒体，而不是全细胞，Sdh5蛋白就很易溶。这样终于能两步法提纯蛋白做质谱分析了，结果又发现Sdh5-TAP不能从抗体珠子上洗脱，最后换成Sdh5-His-HA，才解决了问题，研究马上就有了突破。,生物通：在诺华生物医学研究所接受博后训练后，您对您未来的职业有什么规划吗？ 郝淮湘：我喜欢有应用价值的研究，尤其是和疾病相关的。我之前研究的PASK激酶和肥胖与糖尿病有关，这次的SDH5是抑癌基因。两个研究成果我们都申请了专利，希望将来可以成为药物靶分子。诺华生物医学研究所的博士后项目是一个很独特的机会，既能做很学术化的研究，又能接触药物研发的过程，和我的研究理念很接近。在这里完成博士后训练之后，我希望能到生物制药公司做研发。,
