1、第三章 物理图绘制,学习要点：物理作图的方法各种方法的优缺点,用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序 阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性： 遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。 遗传图的精确性较低：重组热点的存在。 遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。,物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。,1）限制性作图（Restriction mapping）： 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）依靠克隆的基因组作图 (Clone-based mapping
2、) ：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 (Contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）： 将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。 4）序列标记位点作图 （Sequence tagged site, STS）：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。,物理图绘制方法,3.1 限制性作图,3.1.1 限制性作图-小分子DNA,在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列序列可有多种选择，此时采用部分酶切的办法使该区段只发生一次酶切，这称为部分限制作图。,部分限
3、制作图为构建完整的图谱提供了必须的信息。但如果有多个限制位点，这种方法就显得力不从心。特别是内部含有大小相同的片段时，重叠的片段无法区分，使排序变得非常复杂。 一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可见的，我们利用可见的部分大小，确定那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。,1) 制备-琼脂糖包埋法 2) 酶切-稀有酶切位点限制酶 3) 分离-脉冲电泳分离,3.1.2 限制性作图的局限,如果基因组较大，切点较多，单、双、部分 酶切的片段会很多。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子。大分子DNA的研究策
4、略与方法：,1.制备-琼脂糖包埋法,1) 分离纯化细胞核； 2) 将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中； 3) 蛋白酶消化处理细胞核。,2. 稀有切点限制性内切酶的应用,1) 稀有切点限制酶： 在基因组DNA序列中只有很少可识别序列的限制酶， 一般识别位点在6-8碱基对之间, 并含有高G/C比。 2) 选用稀有切点限制酶注意事项：a) 识别位点的非特异序列，-G ANTC- (HinfI)，-GCCN4 NGCC- (BglI)b) 高等生物基因组一般A/T比较高，应选G/C 高比例限制酶，如-GC GGCCGC-(NotI)c) 基因组甲基化状态，人类基因组DNA中5-CG-3的序列较少。,
5、稀有切点限制酶,常规与非常规琼脂糖凝胶电泳,正交变电场凝胶电泳 3.脉冲凝胶电泳,均一脉冲电泳,3.2 基于克隆的基因组作图 -大分子DNA的克隆,基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA 片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)， 绘制物理连锁图。,3.2.1 克隆作图的载体和方法,常规的质粒载体不适用于大分子DNA的克隆。 大分子DNA克隆载体构建:YAC, BAC, HAC, MAC,酵 母 人 工 染 色 体（YAC）,端粒：用于保护线状的 DNA 不被细胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 着丝粒：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中 。在 Y
6、AC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。 自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。,YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达1Mb以上。,YAC 载体的工作原理,YAC的主要缺点： 1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段； 2部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排； 3难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构; 4转化效率低。,细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。 选择标记
7、：氯霉素抗性基因等。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象； 转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取； BAC文库筛选方便。,基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切 酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的 同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体 代表了某种有机体整个基因组。1) 目标基因组大分子DNA的制备；2) 载体制备；3) 载体和DNA的连接；4) 转化；5) 转化子鉴定。,YAC和BAC基因组文库的构建,目标基因组大分子DNA的制备,样品洗涤吸干水分液氮冷冻碾碎离心收集细胞核低融点琼脂糖包埋蛋白酶消化洗涤限制酶部分酶解,插入大分子DNA的分离,载体制备与插入DNA
8、连接,1) YAC载体：制备过程与一般质粒载体相同。 2) BAC载体：低拷贝载体，大量制备，超离心纯化。 3) 酶切：释放接头，接头去磷，减少自连。 4) 连接：将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合, 按重量比1:1，680C保温 5 min，降温至370C，加入连接酶过夜。,思考题： 如何从单条染色体中制备出DNA克隆文库？,染色体步移,3.2.2 重叠群组建,相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重叠群(contig)。,构建重叠群：步移法和指纹法,3.2.3 指纹作图3种指纹,在基因组范围内查找重叠的克隆，最好的方法是克隆指纹排序。指纹指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段组成。
9、,限 制 性 片 段 指 纹 作 图 原 理,限制性片段指纹电泳图,指纹重叠群构建,酵母基因组遗传图与物理图的整合,3.3 染色体细胞图,细胞图：通过原位杂交的方法将基因或DNA 分子标记定位在染色体的某一区段，由此绘制图称为细胞图。 最常用的细胞图绘制技术为荧光原位杂交。（fluorescent in situ hybridization , FISH） 原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法，其必须使染色体DNA 成为单链。,荧光原位杂交,一种封闭杂交探针中重复序列的方法,限制性作图不能用于大型基因组；克隆重叠群复杂，费时费力；FISH难于操作，数据积累慢。
10、目前最有效的物理作图技术，也是能对大型基因 组产生最详尽图谱的技术，是STS作图，主要为 辐射杂种作图。,3.4 序列标签位点 （Sequence tagged site, STS）作图,STS是一段短的DNA序列，其长度通常为100500bp。一段DNA序列要成为STS需满足两个条件： 1.它的序列必须是已知的，便于PCR检测； 2. STS必须在拟研究的染色体上有唯一的定位。,寻找STS的方法 1）从EST序列中寻找 2）SSLP 3）随机基因组序列,1. STS在染色体上的位置是确定的。 2. 两个不同的STS出现在同一片段的机会取决于它们在基因组中的位置，彼此接近，同时出现在同一片段的
11、机会就大，反之则小。,辐射杂种作图原理,STS作图与连锁分析是一样的，不同之处仅在于两个标记间的图距是根据分离频率来计算的。 主要采用的方法是辐射杂种作图。,辐射杂种（放射杂交体）：指含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞。,辐射杂种作图的程序与方法,辐射杂种群,PCR 检测STS标记，根据成对STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度,辐射杂种图距单位,辐射杂种的作图单位为厘镭(centiRay, cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad) X射线剂量下两个分子标记之间发生1%断裂的机率。,利用类似于遗传重组原理和最大似然性的统计学方法来计算存在于DNA片段上的STS之间的断点频率，以此估计标记
12、之间的距离。,Statistical Methods for Multipoint Radiation Hybrid Mapping,人类21号染色体辐射杂种图,人类21号染色体辐射杂种物理图,人类基因组物理图谱:人类基因组序列开始测定时，已有45万个EST，其中有一些重复序列，经计算机分析筛选后得到49625个。再从中筛选出3万个EST、2个辐射杂交系库（分别有83和93个细胞株）、1个有32000个克隆的YAC文库，用于构建物理图谱。构建物理图谱的密度为每个标记183Kb。EST分布结果表明，基因在染色体上的排列是不均匀的。将物理图谱和遗传图谱整合而成更加完整的人类基因组图谱，作为基因组测
13、序的框架和分析的依据。,讨论： 遗传图谱和物理图谱哪一个更加有用？,图谱的应用-定位克隆（图位克隆）,定位克隆（positional cloning）：利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带并对目的基因进行克隆。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。,定位克隆的主要目的之一是将目标基因定位于特定染色体上。A-1型短指（趾）症：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了这一病症，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的经典例
14、子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。,贺林等利用布依族、苗族和汉族的三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。,番茄抗病基因的图位克隆,定位候选克隆,该方法是定位克隆的进一步发展。 将疾病相关基因定位于染色体相关区域； 该染色体区域得到若干候选基因； 进一步分析得到目的cDNA； 蛋白质功能研究。,疾病,染色体定位,若干候选基因,确定目的基因,蛋白质功能,功能克隆,克隆（致病）基因的另一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基
15、因，并对基因进行定位。,性状（疾病）,蛋白质产物（生物学功能）,从氨基酸序列出发设计 DNA引物，从文库调取基因,得到基因序列,染色体定位,疾病,功能,基因,分析异常基因的产物（蛋白质），弄清它是如 何引起临床症状的：纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此 推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针， 然后用探针从cDNA文库或基因组文库中筛选对 应的编码基因；绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷病如白 化病（albinism）、苯丙酮尿症（PKU）和镰刀形 细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采 取的这一策略。,流式细胞仪计数仪 荧光染料对染色体染色。 荧光探测器确定含有正确染色
16、体的液滴发出的信号，并将一个电荷加到液滴上,Science：发现新抑癌基因SDH5 郝淮湘博士从一个功能未知的蛋白入手，发现了一个疾病基因并阐明了其分子功能和致病机理。,SDH5, a Gene Required for Flavination of Succinate Dehydrogenase, Is Mutated in Paraganglioma Huai-Xiang Hao 1, Oleh Khalimonchuk 2, Margit Schraders 3, Noah Dephoure 4, Jean-Pierre Bayley 5, Henricus Kunst 6, Peter
17、 Devilee 7, Cor W. R. J. Cremers 6, Joshua D. Schiffman 8, Brandon G. Bentz 9, Steven P. Gygi 4, Dennis R. Winge 2, Hannie Kremer 3, Jared Rutter 1*,郝淮湘，一位在美国诺华生物医学研究所接受博后训练的80后大男孩，在Science上发表了一篇漂亮的研究性文章，文章被同期的Nature杂志推荐为亮点研究成果。,郝淮湘 19992003年在厦门大学生命科学学院生物科学专业就读，最后一年在长江学者林圣彩教授实验室完成了本科毕业论文。 2003年8月来到美
18、国犹他州盐湖城的犹他大学就读，次年加入医学院生物化学系的Jared Rutter教授实验室，在其指导下进行博士论文研究，2009年5月答辩。 2009年6月至今，在波士顿剑桥的诺华生物医学研究所（Novartis Institutes for BioMedical Research）进行博士后训练。,生物通：作为一名80后的年轻人，您可以说十分年轻，就已经获得生命科学领域的博士学位，能谈谈您出国求学的成长历程吗？可以给我们的青年读者介绍一下在美国学习的感受吗？ 郝淮湘：其实我拿到博士学位并不算早，花了将近六年（20032009），有人四年多就博士毕业了。来美国后第一年主要是上课和在四个实验室轮
19、转（可以从将近100个实验室选择）。这边上课没有教科书，一门课多个教授授课，很多时候都是直接讲文献，一个部分上完就考一次试，记忆的东西不多，主要是分析能力。第二年的时候，我根据自己的兴趣和对导师和课题的判断加入了一个新成立的实验室，跟年轻导师做研究虽然会辛苦一点，但是的确能学很多东西，也有机会了解如何建立实验室和从头构思课题。在此后的5年里，我接触了多个研究项目，一些失败了，最后有两个得以发表，并顺利毕业。总体而言，我觉得美国的博士教育制度还是比较有效的。,生物通：在Science上发表文章很不容易，除了英语要过关外，您还有什么忠告给读者吗？ 郝淮湘：英语的确很重要，但不是最重要的，只要意思表
20、达清楚就可以了，文章接受后编辑会帮助修改的。我觉得最重要的是课题的创新性和意义，所以设计课题的时候就应该多考虑这两个方面，把研究的起点抬高。最后写文章的时候，也要尽可能突出这两方面，尤其是在投稿的说明信（cover letter）和文章的摘要里。,生物通：在您的研究过程中，遇到最大的难题是什么？您是如何克服的？ 郝淮湘：曾经有一段时间，SDH5课题无法进行下去，因为抑制子筛选（suppressor screen）只能找到SDH5本身，而标记的Sdh5蛋白又不溶，不能开展生化研究。我测试了至少十种去垢剂(detergent)和不同的浓度，效果并不好，后来偶然发现如果使用提纯的线粒体，而不是全细胞
21、，Sdh5蛋白就很易溶。这样终于能两步法提纯蛋白做质谱分析了，结果又发现Sdh5-TAP不能从抗体珠子上洗脱，最后换成Sdh5-His-HA，才解决了问题，研究马上就有了突破。,生物通：在诺华生物医学研究所接受博后训练后，您对您未来的职业有什么规划吗？ 郝淮湘：我喜欢有应用价值的研究，尤其是和疾病相关的。我之前研究的PASK激酶和肥胖与糖尿病有关，这次的SDH5是抑癌基因。两个研究成果我们都申请了专利，希望将来可以成为药物靶分子。诺华生物医学研究所的博士后项目是一个很独特的机会，既能做很学术化的研究，又能接触药物研发的过程，和我的研究理念很接近。在这里完成博士后训练之后，我希望能到生物制药公司做研发。,
