1、流式细胞术,09-09-21,流式细胞术简介 流式细胞仪简介 流式细胞术应用 样品的准备 结果分析,流式细胞术简介,流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。,流式细胞仪简介,流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、
2、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具.,流式细胞仪简介,流动室及液流驱动系统 激光光源及光束形成系统 光学系统 信号检测与存储、显示、分析系统 细胞分选系统,流式细胞术应用,细胞生物学：细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的
3、特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。,免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。,血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色
4、法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。,样品的准备,主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。,细胞凋亡研究细胞凋亡是细胞在
5、基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。,细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90角光散射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。,细胞膜功能改变： （1） 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外
6、层，是细胞发生凋亡的早期事件。PS与Annexin （一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高度亲和力。,Flow cytometry of apoptotic cell deathPhospholipid redistribution,应用流式细胞仪采用FITC- Annexin /PI双染法进行细胞凋亡检测，可同时描述三群不同状态细胞：FITC- Annexin -/PI-细胞，即正常活力细胞；FITC- Annexin +/PI-细胞，即凋亡细胞；FITC- Annexin +/PI+细胞，即已死亡细胞。此种方法操作过程简单，指标敏感，应用者越来越多。,PI/Hoechst33342双染法
7、：Hoechst33342（HO）是一种DNA的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜，应用PI/Hoechst33342可将细胞分为三群：正常活细胞（HO强/ PI-），凋亡细胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡细胞发生DNA降解和丢失，导致HO荧光减弱），死亡细胞（HO弱/ PI+）。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但HO须紫外光激发，由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。,吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)双染法: AO是一种异染性荧光染料,可通过完整的质膜,它与核酸的结合主要是嵌入DNA双链的碱基之间，其发射峰为530nm，呈绿色荧光。EB的理
8、化特性与PI相似，不能通过完整质膜。应用AO/EB双染法也可以将细胞分成三群：正常活细胞（AO强/ EB -），凋亡细胞（AO弱/ EB -），死亡细胞（AO弱/ EB +），原理与PI/Hoechst33342双染法相似，不同的是AO/EB双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光（488nm），而不须紫外光，其缺点是染色过程较复杂，且AO易污染设备管道，因此使用此法者较少。,放线菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，最后通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：
9、7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、价格便宜等优点。另外，由于此法不破坏细胞膜，故还可联合使用FITC、PE标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析(虽然AO/EB双染法也不破坏被检细胞膜,但由于AO及EB的发射光波谱分别与FITC和PE的发射光波谱相似，故AO/EB法不能与FITC和或PE联合使用)。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。,细胞器改变： 线粒体膜APO2.7蛋白表达：早期凋亡细胞的线粒体膜出现APO2.7蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。 DN
10、A含量变化： 主要是PI染色法，由于凋亡细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低DNA含量细胞、由于机械损伤产生DNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。,DNA断裂点标记：细胞凋亡时发生DNA断裂,利用末端转移酶(TdT)可以将
11、dUTP标记到断裂点上,称作原位缺口末端标记（TUNEL）技术。此法有直接标记和间接标记两种，前者的标记物是FITC-dUTP，后者的标记物是生物素(biotin)标记的dUTP,需要再用FITC标记的亲和素(avidin)与生物素标记的dUTP结合，使标记反应倍增，故间接标记法灵敏度高，但操作较复杂。TUNEL还可以配合其它单抗同时进行细胞表型分析，或与DNA含量同时分析。TUNEL法因其灵敏度高而被广泛采用。,细胞凋亡相关基因产物检测：细胞凋亡是一个多种基因参与的复杂过程,目前已知与bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有关，这些基因都有相关产物，目前针对这些相关产物已有单克隆抗体生
12、产，应用这些单抗，通过流式细胞仪可检测造血细胞凋亡相关基因蛋白表达水平，相互关系 。,流式细胞仪测定细胞凋亡方法、层次众多，且具有快速、准确特点，应用十分广泛。在实际应用中应注意采用多种方法结合使用，使结果更加可靠准确。,细胞凋亡流式检测,固定细胞的染色方法 非固定细胞的染色方法,固定细胞的染色方法,PI单染色法 （1）,1收集细胞（15）106个，5001000r/min离心5min，弃去培养液。 23ml PBS洗一次。 3离心去PBS，加入冰预冷的70的乙醇固定，4，1h。 4离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 5400目的筛网过滤1次，5001000r/min离心5min，弃
13、去PBS。 6用1ml PI染液，4避光30min。 7流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。,PI单染色法 （2）,1收集细胞（1106个），5001000r/min离心5min，弃去培养液。 21ml PBS/FCS洗一次。 35001000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500l PBS/FCS和500l的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4下固定4min。 45001000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2 Tween的PBS 1ml，37孵育1
14、5min。 51ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 6400目的筛网过滤1次。 75001000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。,调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析,1离心收集细胞，PBS洗12次。 21多聚甲醛低温下固定15min。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱内放置13天。 4PBS轻洗1次 5细胞与TdT标记液37孵育，时间12h。 6PBS轻洗1次。 7细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS轻洗1次。 91m
15、l PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 10 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。,ISNT的流式细胞仪分析,1离心收集细胞，PBS洗12次 21多聚甲醛低温下固定15min。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱内放置13天。 4PBS轻洗1次。 52105细胞与12.5l的缺口平移缓冲液在15共孵育6h，每过15min振动1次。 6PBS轻洗1次。 7细胞在黑暗中37与100l的染色缓冲液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS轻洗1次。 91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬
16、。 10 流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图,非固定细胞的染色方法,Hoechst 33342/PI双染色法,1悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1g/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02EDTA的0.25胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1g/ml，37孵育710min。 24 5001000r/min离心弃去染液。 3加入1.0ml PI染液，4避光染色15min。 4400目的筛网过滤1次。 5流式细胞仪分析。,Annexin V/PI双染色法,1细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（15）106，5001000r/min离心5min弃去培养液。 2用孵育缓冲液洗1次，5001000r/min离心5min。 3用100l的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育1015min。 45001000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。 5加入荧光溶液4下孵育20min，避光并不时振动。,结果分析,Annexin V,PI,谢谢,
