1、流式细胞术,流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点,流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。,第一节 流式细胞仪
2、,BD FACS Calibur ( BD流式细胞仪 ）,采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,一、工作原理,（1） 液流系统（2） 光学系统（3） 数据处理系统,1.流式细胞仪的基本结构：,由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心
3、位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（1）液流系统,液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱,液流驱动系统（示意图）,流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,液流系统示意图,激光光源：气冷式氩离子激光器 透镜组：形成平行光，除去室内光 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）,（2）光学系统,光学系统示意图,PMT,PMT,PMT,PMT,Dichroic,
4、Filters,Bandpass,Filters,Laser,1,2,3,4,Flow cell,激光、透镜组、光电倍增管等。,主要由计算机及其软件组成,（3）数据处理系统,细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为 前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定,前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,前向散射光示意图,侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细
5、胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。,侧向散射光示意图,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和
6、对数放大器,三、荧光测量,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,四、细胞分选原理,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术,第二节 数据的显示与分析,FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、 参数,单参数直方图 双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图 三参数直方图 多参
7、数分析,直分析方图,设门分析:REGION和GATE设置,二、数据显示方式,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数直方图,1.双参数直方图点图,双参数直方图点图,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,2. 二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参
8、数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,二维等高图,3. 假三维等高图,（三）三参数直方图,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术
9、,A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,荧光素种类,FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发,流式细胞仪常检测的细胞特性,小结,基本工作原理,基本过程,流式细胞仪与显微镜的区别,
