流式细胞术原理.pdf

1、流 式 细 胞 术 苏 黎 北京大学医药卫生分析中心 细胞分析室 联 系 电 话： 82805034 82802437 2 流式细胞仪内部结构 光学系统 激光光源 光收集系统 液流系统 流动室 液流驱动系统 电子系统 光电转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转板 样品收集器 3 流式细胞仪 与 血细胞 检测仪 的共同特点：对液体中的各种细胞及其多种特性进行定量分析。 教学参考书 流式细胞术的原理和应用。宋平根，李素文主编。 北京师范大学出版社。 1992.3 实用流式细胞术彩色图谱。王书奎，周振英主编。 上海第二军医大学出版社。 2004.4 临床流式细胞分析。王建中主编。 上海科学

2、技术出版社。 2005.8 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。 北京大学医学出版社。 2008.2 4 流式细胞仪的结构与原理 流式细胞仪的数据获取与分析 流式细胞术的样本制备 流式细胞术的应用 流式分选原理及其 应用 5 流式细胞仪的结构与原理 流式细胞术和流式细胞仪的简介 流式细胞仪的结构 流式细胞仪的信号检测 原理 6 什么是 流式细胞术 流式细胞术（ Flow Cytometry, 简称 FCM） 是一种对 单个 细胞或生物颗粒 的物理 或化学 特性进行 快速测量和定量分析 的方法 ，同时也是一项可以用 物理 方法 对细胞 亚群或亚细胞 结构进行 分离 和 富集 的 高科技技术 。

3、流式细胞仪 （ Flow Cytometer）：就是进行流式细胞分析的仪器，是一种集 激光 技术 、 流体力学 技术、 电子 物理 技术、 光电测量 技术、 电子计算机 技术、 细胞化学 技术、 抗体 技术为一体的新型高科技仪器 。 7 流式细胞术的 特点 分析对象 ： 流动 的单细胞 或生物颗粒悬液 分析速度： 快速 （最高达数万个细胞 /秒） 检测内容：细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、蛋白质 、抗原、离子 或核酸等） 检测参数： 多参数 （两个散射光参数、多个荧光参数） 可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球阵列 技术 (Cytometric Beads Array, CBA) 检

4、测结果：精度高、准确性好 、可重复性好 8 流式细胞仪的发展与商品化： 起源于细胞计数自动化： 1934年 Moldavan首先报道了一种流动细胞自动计数装置。显微镜 +稳定压力 +毛细玻璃管 1953年， Crosland-Taylor运用鞘液原理，设计了流动室，用快速流动的液柱包裹悬浮 的轴流中的细胞 、 实现快速不拥堵的细胞 计数，从而建立了流体动力聚焦原理。 流式技术液流原理的基础 。 1959年， Coulter申请了“流动的悬浮粒子计数”专利，并据此生产出 第一台血细胞计数器。 根据 Coulter原理 ，信号脉冲的幅度和宽度与细胞或颗粒的体积有关，从而区分不同大小的颗粒并计数。

5、1965年， Kamentsky提出了用分光光度学定量测量细胞组分，不同组分同时测量实现了细胞分类。他是第一 个用二维直方图显示流式参数和用 计算机实现多参数分析的 人。其测量 速度可达 500个 /秒 ，还实现了仪器商品化 (Ortho Cytograph和 Cytofluorograph)。 9 流式细胞仪 的发展与商品化： 1967年， Van Dilla和 Los Alamos小组率先发展了 一种液流束、照明光轴和检测系统光轴三者相互垂直的 流式细胞计 ， 运用 了 Crosland-Taylor的鞘流 原理和氩离子激光器 。后来又将Coulter计数器运用进去，研制出了现代意义上的

6、流式细胞仪。他们首次实现了细胞中 DNA定量分析，用直方图 清楚显示了细胞周期中 G1时相、 S时相、和 G2/M时相。 1972年， Len Herzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪 (FACS)，氩离子激光，标志着 流式细胞仪商品化时代到来 。 10 流式细胞仪的发展及 商品化 1973年： Becton Dikinson (BD)公司将其投入 市场， 第一台 FACS- 问世 ，其后 20多年来不断改进完善产品，先后推出FACSAnalyzer、 FACScan、 FACSCalibur、 FACSLSR- 、FACSVantage、 FACSDiva、 FACSAria

7、、 FACS Canto等 1975年： Coulter公司 TPS-1问世，可做双参数分析 ，随后不断推出各种型号仪器， EPICS C、 EPICS-Profile、 EPICS-ELITE等。 1994年：美国 Cytomation公司推出高性能、 高速分选装置 MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受到广泛关注。 2008年，美国 BD公司推出 Influx，在 MoFlo基础上实现了原位、立体分选。 其间仍不断有新的品牌型号推出市场，如德国 Partec、密理博Guava、 ABI等。 2011年美国 Stratedigm公司推出 4激光 18参数的S1000 EX。

8、 11 流式细胞仪的 分类 临床型：临床检验 资质 SFDA认证。光 路调节系统固定，自动化程度高， 操作 简便，易掌握， 适用于临床常规测试 。 科研型 ：分辨率高，选配多种波长和类型 激光器 ，可将感兴趣细胞分选到特定容器或 孔板上 ，适用于科研 。 12 13 Beckman公司的流式细胞分析仪 GALLIOS （临床型） （临床型） 医学部 Peking University Health Science Center 14 BD公司的流式细胞分析仪 FACS Calibur （临床型） LSRII FACS Count（临床型） FACS Canto （临床型） 15 其他新型流式细

9、胞分析仪 BD Accuri C6 BD FACSVerse Stratedigm S1000 EX Guava easyCyte 6HT-2L 医学部 Peking University Health Science Center 16 DxFLEX （临床型） BD LSRFortessa 其他新型流式分析仪 纳米流式 17 A50 Micro (Apogee) NanoFCM(厦大研发 ) 流式细胞仪的结构与 原理 流式细胞术和流式细胞仪简介 流式细胞仪的结构 流式细胞仪的信号检测 原理 18 流式细胞仪内部结构 光学系统 激光 光源 光 收集系统 液流系统 流动 室 液流 驱动系统 电

10、子系统 光电 转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转 板 样品 收集器 19 医学部 Peking University Health Science Center 光学 系统 激发光源 种类 弧光灯 ： 氙灯 、高压汞灯：价廉，激发光谱广（优点）； 单一 谱线上能量弱、功率不稳定（局限性） 激光器 ： 气体激光器 ： 氩离子 （ 488nm）、 氦 氖 (633nm）、氪离子（ 647nm)、氪 氩（ 568nm） 染料激光器 ：如氩离子激光泵浦的 Rhodamin 6G水溶液染料激光器， 发出 550-650nm可变波长激发光 半导体激光器 ：价格低、结构简单、寿命长。如 BD的

11、FACS Calibur采用 635nm半导体激光器 20 医学部 Peking University Health Science Center 激光特点 ： 相干光源 、单波长、高能量、小发散角、 高 稳定性光照 目前主流产品标准配置 ： 采用 氩离子或 氦氖激光器 仪器 选配 2-4根激光： 488nm 、 633nm、 355nmUV或 405nm 高端流式细胞仪： 激光器 可配到 6根，波长多为 488nm 、 633nm和 355nmUV、405nm、 444nm、 561nm 最多 可同时检测 18个参数（ 2个散射光参数， 16个荧光参数 ） 21 医学部 Peking Uni

12、versity Health Science Center 光学系统：光信号分离， 导向 22 23 24 医学部 Peking University Health Science Center 流式细胞仪的光学 系统（单激光） 25 激光器 SSC及荧光收集器 流动室 聚焦棱镜 FSC收集器 医学部 Peking University Health Science Center 26 光收集系统：滤光片 Longpass Shortpass Bandpass 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500 LP 500 BP500/50 医学部 Peki

13、ng University Health Science Center 流式系统的三种滤光片 27 流式细胞仪内部结构 光学系统 激光 光源 光 收集系统 液流系统 流动 室 液流 驱动系统 电子系统 光电 转换器 数据处理系统 细胞分选系统 喷嘴 电偏转 板 样品 收集器 28 医学部 Peking University Health Science Center 液流 系统 流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交 液流驱动系统（压力泵）：空气泵 +压力传感器 29 医学部 Peking University Health Science Center 流动室 与 液流驱动系统 模拟图 30