1、结核分枝杆菌(M.tuberculosis),昆医附一院呼吸内二科 吕树志,历史,Figure 1-2: Representation of a woman with pronounced gibbus (Potts disease?). Momil culture, 200 BC to 100 AD, Sin River, Colombia (reproduced from Sotomayor 1992, with permission).,我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核
2、病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。,1882年3月24日Koch发现结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是分枝杆菌属内对人类及动物致病的主要病原菌。典型的结核分枝杆菌的形态为细长稍弯曲或直的，两端圆钝的杆菌，长14微米，宽0.30.6微米，单个散在，有时呈X、Y形或条索状。痰标本涂片经过抗酸染色后在100倍的生物显微镜下可以看到。,一、 生物学性状,形态与染色 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小14X0.4m。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的
3、60%，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。,分群（Mitchson假说）,A菌群：快速繁殖，巨噬细胞外和肺空洞干酪液化部分； B菌群：半静止状态，巨噬细胞内和空洞璧坏死组织中； C菌群：半静止状态，可突然间歇生长。 D菌群：休眠状态，不繁殖，数量很少。,染色,分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl- Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。,培养特性,专性需氧。最适温度为37，低于30不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。
4、在一般培养基中每分裂1代需时1824h，营养丰富时只需5h。,常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般24周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。,生化反应,结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性; 非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。,抵抗力,结
5、核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。粘附在尘埃上保持传染性810d，在干燥痰内可存活68个月。结核分枝杆菌对湿热敏感，在液体中加热626315min或煮沸即被杀死。结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。,变异性,结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin 二人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。,耐药性,在
6、固体培养基中对常用的含异烟肼1mg、链霉素10mg、利福平50mg能生长的结核分枝杆菌为耐药菌。耐药菌株毒力有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝菌酸的合成，诱导结核分枝杆菌成为L型,此可能是耐异烟肼的一种原因。药物敏感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平和链霉素大多仍敏感。,结核分枝杆菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由用药不当经突变选择产生（继发性耐药）。但多耐的产生主要可能由于后者。耐药基因在染色体上，对不同药物的耐药基因不相连接，所以联合用药治疗有效。 对异烟肼耐药与katG基因丢失有关; 利福平主要作用于RNA多聚酶。编码该酶的基因(rpoB)突变则引起对利福平耐药。,MDR-TB (
7、耐多药结核),指结核菌至少对包括异烟肼和利福平在内的两种以上的抗结核药物产生了耐药性的结核病。 XDR-TB(严重耐药结核) ,是除耐多药结核之外对任何氟喹诺酮类药物以及三种二线注射药物（硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星）中至少一种具耐药性的结核。,持留现象,持留性：是结核分支杆菌在感染宿主体内存留的一种无可争辩的现象。在潜伏感染或临床感染整个过程中，在“逆境下保持其在组织内稳定和对环境的无反应性”。 感染潜伏性：任何不表现临床症状的结核性病变。 休眠性：潜伏感染和或患病过程中整体或病变或病变局部内结核分枝杆菌代谢和病理学的“静止”状态。,二、致病性,结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能
8、与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。 致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。,荚膜,荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌的作用有： 荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵； 荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养； 荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易进入。,故结核标本用4% NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。,脂质,据实
9、验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关，特别是糖脂更为重要。 索状因子 ： 是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌中提出，则细菌丧失毒力。 磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节。,硫酸脑苷脂：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。 蜡质D:是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应。,蛋白质,有抗
10、原性，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。,免疫性,免疫机制 结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌接触起辅助作用。,结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%90% 是巨噬细胞，10% 是淋巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。,致敏淋巴细胞可产生多种淋巴
11、因子，如IL-2、IL-6、INF- ，他们与TNF-的共同作用可杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INF- 是主要的，有多种细胞能产生INF- ，浸润的先后为NK、Ts/Th和CD4+、CD8+/T细胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介物的产生而将病菌杀死。,机体内的T细胞根据抗原受体（TCR）的不同可分2种：一种由链与链组成，称/T细胞（含CD4或CD8标志）,另一种由链和链组成，称 /T细胞（大多无CD4或CD8标志）。人与小鼠外周血中前者90%，后者10%。在抗分枝杆菌免疫中这2种T细胞均起到重要作用
12、。在感染早期/T细胞尚未升至高峰时，结核分枝杆菌受 /T细胞控制。在与结核分枝杆菌接触后 /T细胞即大量增殖。健康人经分枝杆菌提取物刺激710d后，外周淋巴细胞中/T细胞可有所增加，其作用与/T细胞同样可杀伤结核分枝杆菌。,近年来注意到/T细胞攻击的主要是分枝杆菌中的一种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)。HSP是一种具有高度保守性的蛋白质，从原核细胞到动植物中均有，其氨基酸顺序有50%同源。在正常生物中含量极少，但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改变时即大量产生，故HSP又称应激蛋白(stress protein)。HSP在许多病原菌中均有，其氨基酸序列有共同成分
13、，不同细菌引起的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫，被认为是非特异性免疫。,结核的免疫属于感染免疫(infection immunity)，又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，免疫也随之不存在。 随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导。,免疫与超敏反应,Koch 现象:将结核分枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下, 1014d后局部溃烂不愈，附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表现为原发感染的特点。若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染 ，则于12d内局部迅速产生溃烂，易
14、愈合。附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散，表现为原发后感染的特点。可见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，表明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡发生快，说明在产生免疫的同时有超敏反应的参与。,近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主要由结核菌素蛋白和蜡质共同引起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA引起。二种不同抗原成分激活不同的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。,结核菌素试验,结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。 1.结核菌素试剂：旧结核菌素：系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养48周后加热浓缩过滤制成。
15、稀释2 000倍，每0.1ml含5u。目前都用纯蛋白衍化物，PPD有二种：人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5u。,2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，4872h后:硬结4mm者为阴性；5-9mm为弱阳性；10-19mm为阳性；20mm或虽20mm，但局部出现水泡和淋巴管炎，为强阳性。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种所致。,阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌，但应考虑以下情况：感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应老年人严重结核患者或患
16、有其他传染病，如麻疹，水痘导致的细胞免疫低下获得性细胞免疫低下，如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。,微生物学检查法,标本 标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。,直接涂片镜检,标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用IK(intensified Kinyoun)法染色。将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧
17、光。,涂片法,抗酸杆菌（）：连续观察300视野未发现； 抗酸杆菌（）：连续观察300视野发现1-3条; 抗酸杆菌（1）：1-9条/100视野 抗酸杆菌（2）：1-9条/10视野 抗酸杆菌（3）：1-9条/1视野 抗酸杆菌（4）：10条/1视野,浓缩集菌,先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH（痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒
18、内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。,分离培养,将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需24周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于12周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。,培养,罗氏
19、培养基，一般需2-6周，阳性结果随时报告，8周无菌生长，报为阴性结果，阳性结果按生长菌落占斜面1/4,1/2,3/4和全部划分1+到4+,动物试验,将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下，34周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。若68周仍不见发病，也应进行解剖检查。,快速诊断,一般涂片检查菌数需5x1034/ml,培养需1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。,菌阴结核,三次涂片及一次培养阴性的肺结核，诊断标准：典型临床症状和胸部x线表现；抗结核治疗有效；临床可排除其他非结核性肺部疾患；PPD强阳性，结核抗体阳性；痰结核菌PCR和探针检测阳性；肺外组织病理证实结核病变；支气管肺泡灌洗液检出分枝杆菌；支气管或肺部组织病理证实结核病变。具备中3项或、中1项可确诊。,谢谢,
