1、 SZDB/Z 1262015 I SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 人类间充质干细胞库建设与管理规范 2015 - 02 -06 发布 2015-03 -01 实施 深圳市市场监督管理局 发布 ICS 07.080 C 04 SZDB/Z 126-2015 SZDB/Z 1262015 II 目 次 前言 . III 1 范围 .1 2 规范性引用文件 .1 3 术语和定义 .1 4 生命伦理 .4 5 人类间充质干细胞库建设 .4 6 机构设置 .5 7 操作规范 .6 8 安全管理 10 附录 A（资料性附录） 供者健康信息
2、采集 .16 附录 B（资料性附录） 人类间充质干细胞样本编码规则 .17 附录 C（资料性附录） 人类间充质干 细胞库整体的操作流程 .18 参考文献 19 SZDB/Z 1262015 III 前 言 本指导性技术文件按 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由深圳市经济贸易和信息化委员会归口。 本标准负责起草单位：深圳华大基因研究院。 本标准主要起草人：周欣、 张勇、张曦 、 冀旭 、 燕舞、林洁璇、张家文、黄海军、彭冬秀、孙长斌、杨阳、黎苑杰 。 本标准为首次发布。 SZDB/Z
3、1262015 1 人类间充质干细胞库建设与管理规范 1 范 围 本标准规定了人体来源 间充质干细胞库 相关的 生命伦理、间充质干细胞库 建设、 机构设置 、 操作规范和安全管理 的基本方法。 本标准适用于人体来源 间充质干细胞库 的建设 与管理规范 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写 GB 2894-2008 安全标志及其使用导则 GB/T 5458-2012 液氮生物容器 G
4、B 7000.2-2008 应急照明灯具安全要求 GB/T 12905-2000 条码术语 GB 13690-2009 化学品分类和危险性公示通则 GB 15258 化学品安全标签编写规定 GB/T 17172-1997 417 条码 GB/T 18347-2001 128 条码 GB/T 18883-2002 室内空气质量标准 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB 19652-2005 放电灯（荧光灯除外）安全要求 GB/T 20269-2006 信息安全技术信息系统安全管理要求 GB/T 22278-2008 良好实验室规范原则 GB/T 27025-2008 检测和校
5、准实验室能力的通用要求 GB 50016-2006 建筑设计防火规范 GB 50034-2004 建筑照明设计标准 GB 50052-2009 供配电系统设计规范 GB 50140-2005 建筑灭火器配置设计规范 GB 50346-2012 实验室建筑技术规范 GB 50351-2005 储罐区防火堤设计规范 AQ 3013-2008 危险化学品从业单位安全标准化通用规范 CNAS-CL05-2009 实验室生物安全认可 准则 MH/T 1019-2005 民用航空危险品运输文件 WS/T 224-2002 真空采血管及其添加剂 WHO Third Edition 实验室生物安全手册 3 术
6、语和定义 SZDB/Z 1262015 2 下列术语和定义适用于本指导性技术文件： 3.1 干细胞库 stem cell bank 用于储存不同 来源 干细胞的专门机构。 3.2 样本 specimen 在特定时间从受试者或捐献者中采集的 器官、 组织等 标本 。 3.3 接收区 receiving zone 样本到达时用于初步检查、清点接收或样本转移前进行包装、清点的缓冲区域。 3.4 冷藏区 refrigerated storage zone 为样本提供冷藏储存环境（ 2 8 ）或冷藏设备（温度为 2 8 ）的区域。 3.5 冷冻区 frozen stora
7、ge zone 为样本提供 0 以下储存环境或设备的区域。根据低温程度的不同，可分为普通低温冷冻储存区（ 4低温设备区）、超低温冷冻储存区（ 86 低温设备区）、深低温冷冻储存区（ 135 以下低温设备区）。 3.6 细胞制备 cell preparation 细胞样 本 经过一系列规范 处理 达到 入库 标准的过程。 3.7 质量控制 quality control 为 达到 入库 质量要求所采取的操作技术和活动。 3.8 样本编码 sample coding 根据编码规则对样 本 进行编号的过程。 3.9 细胞分离 cell isolation 从机体组织 或 器官中分离出单个细胞的过程。
8、 SZDB/Z 1262015 3 3.10 原代培养 primary culture 直接从机体取下组织 、 器官 或 细胞后立即进行的培养 过程 。 3.11 传代培养 subculture 当原代培养成功后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，为避免发生接触性抑制，将培养物分割成小的部分，重新接种到 新 的培养器皿（瓶） 的培养基中 进行的培养 过程 。 3.12 细胞冻存 cell cryopreservation 使细胞暂时脱离生长状态而 保存其 细胞特性的方法。 3.13 细胞复苏 cell thawing 使细胞从脱离生长状态重新获得生长活力的方法。
9、 3.14 冻存管 tube 在 细胞冻存过程中用于储存细胞的 特殊 密封 的无菌 小管。 3.15 液氮罐 liquid nitrogen container 用于储存细胞的 一种深 低温冷冻 设备 。 3.16 生物危险 biohazard 因生物因子导致的直接或潜在的危险。 3.17 实验室生物安全 laboratorial biosafety 实验室的生物安全条件和状态不低于允许水平 ，并 符 合相关法规和标准对实验室生物安全责任的要求，避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害。 3.18 化学安全 chemical safety 使用化学物品时遵守一定的规范 并 有相应
10、的紧急预案应对事故 ,防止危险化学品事故的发生 并 将事故的影响或损失降至最低。 3.19 SZDB/Z 1262015 4 知情同意 informed consent 具 有完全民事行为能力的自然人，在充分获取信息并准确理解其内容后，作出参与研究的决定，应签署知情同意书，一式两份。此决定不受恐吓、利诱或其他不当行为的影响。 3.20 生命伦理 bioethics 指生命科学和卫生保健 领域内人类行为的 道德规范 和原则。 3.21 伦理审查委员会 ethical review committee 负责对科学研究中涉及的伦理道德问题进行评估和审查的专门 组织 。
11、 3.22 科学审查委员会 scientific review committee 负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查的专门 组织 。 3.23 生物安全评审委员会 institutional biosafety committee 负责 制定 生物安全政策和安全操作规范的专门 组织 。 4 生命伦理 4.1 知情同意 人类间充质干细胞库的工作人员应当对风险及收益进行有效评估， 确保样本提供者或其近亲属对项目信息充分知情、形成全面和准确的认识，自愿做出是否同意的决定，并签署知情同意书。 4.2 隐私保护措施 研究人员、医务人员应当对样本提供者的个人信息采取保密措施，若确需提供，需要提
12、交科学委员会批准后方可提供。违反法律规定的，应依法追究民事责任、行政责任和刑事责任。 4.3 安全保护 研究人员或相关医务人员在获取样本的过程中一般为最小风险，不增加样本提供者的额外风险。避免为取样本而置样本提供者于危险之中。 5 人类间充质干细胞库建设 5.1 人类间充质干细胞库场地建设及要求 SZDB/Z 1262015 5 5.1.1 人类间充质干细胞库场地选择要符合干 细胞制备实验室以及干细胞长久低温保存的要求。 5.1.2 符合人类间充质干细胞实验室要求，是指干细胞制备过程中无菌、无病毒、无生物化学物质、无尘和无噪音等污染如垃圾场旁、医院废弃物旁、道路
13、旁和闹市中等地方不能作为人类间充质干细胞库建设场地。 5.1.3 符合长久保存要求，是指不能频繁更换保存场地，因此将要进行拆迁的建筑，易发生自然灾害 (如易发生洪水、泥石流、海啸和火山爆发等 )的地方不能作为人类间充质干细胞库建设场地。 5.1.4 人类间充质干细胞库的建设设计应符合 GB 19489-2008的规定，功能区域应至少包括样本接收区、样本预处理区、干 细胞培养区、干细胞操作区、干细胞冻存区、人类间充质干细胞库和医疗废弃物处理区等区域，每个区域应标识洁净和风险级别。 5.1.5 人类间充质干细胞库的办公区与实验区之间应有墙壁进行物理隔开，工作人员由安全通道进入实验区，办公区域的通风
14、系统应与实验区域的通风系统独立分开，以确保办公区域的空气质量不受实验区域空气的影响。 5.1.6 人类间充质干细胞库的建设应由具有实验室建设资质的工程公司进行建设，建设过程中所使用工人应为上岗员工，不得随意更换建设人员。人类间充质干细胞库的建设所用材料应符合要求，达到防强酸、防强碱、防震等效果。人类间充 质干细胞库建设完成后，各功能区域的洁净级别应由专业的检测人员进行检测并出具合格证明。 5.2 实验室设施与设备 5.2.1 空调与通风系统 5.2.1.1 通风系统应符合 GB/T 18883的规定，气流由“清洁”空间向“污染”空间流动，最大限度减少室内回流与涡流。 5.2.1.2 人类间充质
15、干细胞库实验室空调系统应符合 GB 19489-2008的规定，有足够的温度和湿度控制能力，实验室各个区域的温度与湿度应控制在规定范围内。 5.2.2 照明系统 人类间充质干细胞库的照明系统应符合 GB 19489-2008的规定，干细胞库及实验室的核心工作区的照度不低于 350勒克斯，其 它区域不低于 200勒克斯。 5.2.3 备用电源 人类间充质干细胞库实验室的供电系统应符合 GB 50052和 GB 19489-2008的规定，应急照明不得少于 30分钟，需安装后备电池或者与后备发电机相连，并符合 GB 7000.2的规定。 5.2.4 安全设施 人类间充质干细胞库的安全设施应符合 G
16、B 19489-2008的规定，包括门禁、监控、报警和危险处理系统。 6 机构设置 6.1 伦理审查委员会 SZDB/Z 1262015 6 6.1.1 人类间充质干细胞库设伦理审查委员会。伦理审查委员会由医药学、伦理学、法学等专家以及无利害关系的社区代表等人员组成。 6.1.2 伦理审查委员会对相关伦理问题 进行审查和评价。伦理审查委员会负责建立干细胞库的伦理准则和相应的伦理操作规范，并在科学性前提下对样本相关研究项目开始前进行伦理审查及对已通过审查或正在进行的项目进行伦理监督与审查，以保护样本提供者的权益和安全。 6.2 科学审查委员会 6.2.1 人类间充
17、质干细胞库应设有科学审查委员会。科学审查委员会应由生物和医学领域的专家组成。 6.2.2 科学审查委员会应负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查。 6.3 生物安全评审委员会 6.3.1 人类间充质干细胞库应设有生物安全评审委员会。生物安全评审委员会应由生物学家、医务人员、技术人员和实验室管理人员等各 方面的专家或工作人员组成。 6.3.2 生物安全评审委员会负责干细胞库的生物安全政策和安全操作规范的审查。 7 操作规范 7.1 采集 7.1.1 采集场所 7.1.1.1 人类间充质干细胞样本的采集场所或环境需达到相应洁净度，保证无菌采集，标本可用。 7.1.1.2 牙齿样本和经血样本的
18、采集场所无特别要求，需注意个人卫生。 7.1.1.3 羊水样本、新生儿脐带、脐带血和胎盘样本、人类骨髓液样本的采集场所需达到级一般洁净手术室要求。 7.1.1.4 人类脂肪组织、滑膜组织和宫内膜组织样本的采集场所需达到级普通洁净手术室要求。 7.1.2 采集方法 7.1.2.1 总则 人类间充质干细胞库应针对不同样本制定相应标准采集方法和管理 制度，并在符合 GMP的标准上严格执行。人类间充质干细胞样本需由专业的医护人员或接受过样本采集专业培训的人员进行。以下方法为人类间充质干细胞库建议或可用样本采集方法。 7.1.2.2 新生儿脐带来源间充质干细胞样本采集方法 a) 待胎儿娩出后，用蘸有 7
19、5%酒精的纱布擦拭脐带； b) 截取至少 15厘米无针孔的脐带放入保存液中，标识清楚，置于无菌采集袋中； c) 脐带的两端需要用手术线结扎。 7.1.2.3 新生儿胎盘来源间充质干细胞采集方法 a) 胎儿娩出后，待胎盘与母体完全分离，用蘸有 75%酒精的纱布擦拭； b) 迅速将胎盘放入保存液中； SZDB/Z 1262015 7 c) 将胎盘放入无菌采集袋，清晰标识 。 7.1.2.4 新生儿脐带血来源间充质干细胞采集方法 a) 待新生儿娩出后，断脐结扎。用蘸有 75%酒精的纱布擦拭胎盘远端脐带。 b) 采血针穿刺消毒部位脐静脉，引流脐带血至脐带血采集袋，至无脐
20、带血流出。 c) 旋紧采血袋软管旋塞，或做热合处理，并清楚标识。 7.1.2.5 人类脂肪来源间充质干细胞采集方法 a) 脂肪组织采集前应联系整形医师，制定抽脂方案和术前术后的防感染措施。 b) 行脂肪抽吸术，抽取脂肪组织，置于无菌采集袋中保存，并清楚标识。 7.1.2.6 人类牙髓来源间充质干细胞采集方法 a) 采集儿童正常生长期即将脱落乳牙，或成年人正畸或阻生需拔除的第三磨牙。 b) 采集之前清洁 口腔；并用棉球擦拭牙齿四周进行消毒。 c) 用拔牙器械拔出牙齿，即时转移到无菌保存液中保存，并清楚标识。 7.1.2.7 人类骨髓来源间充质干细胞采集方法 a) 骨髓组织采集前应联系外科医师，制
21、定骨髓穿刺方案和术前术后的防感染措施。 b) 行骨髓穿刺术，抽取骨髓液，即时转移至无菌采集袋中保存，并清楚标识。 7.1.2.8 人类子宫内膜间充质干细胞采集方法 a) 手术切除成年女性子宫内膜增厚组织或子宫内膜异位组织，置于采集液中保存，并清楚标识。 b) 成年女性月经期第二天或第三天，将月事杯消毒后置于阴道内，收集经血。月事杯取出后，将经血转移至保存液中保存，并清楚标识。 7.1.2.9 人类羊水来源间充质干细胞采集方法 a) 在孕妇妊娠中期，妊娠 16 20周时进行羊水穿刺。 b) 在 B超引导下，抽取羊水样本。 c) 将羊水样本转移至无菌采集袋中，并清楚标识。 7.1.2.10 人类母
22、乳来源间充质干细胞采集方法 a) 清水煮沸吸乳器 3 5分钟灭菌。清洁双手，并 75%酒精消毒哺乳期女性乳头及周围部位。 b) 依照吸乳器操作说明，采集母乳。 c) 将母乳转移至采集液中保存，并清楚标识。 7.1.2.11 人类滑膜来源间充质干细胞采集方法 a) 无菌环境下，手术采集供者关节处滑膜组织样本。 b) 采集后将样本立即转移至保存液中保存，并清楚标识。 7.2 样本接收 7.2.1 样本接收应遵从安全与准确 的原则，做到样本与供者一一对应。 7.2.2 样本接收时，做好自我防护工作，接触样本之前应戴好手套与口罩。 7.2.3 首先送达接收室的运输箱内样本及信息记录表是否齐全，同时确认
23、记录表上应该记录的信息已经填写完成。 7.2.4 观察样本容器外包装的外观，检查有无破损并记录。 SZDB/Z 1262015 8 7.2.5 检查信息记录表上信息是否与样本信息一一对应，确认无误后进行接收。 7.2.6 接收样本后用医用酒精把容器外表面擦拭干净，如不能及时对样本进行处理，要把样本保存在规定保存条件下。 7.2.7 样本接收后应及时将信息反馈给样本发送方。 7.3 人类间充质干细胞的分离与原代培养方法 7.3.1 总则 人类间充质干细胞库应 建立人类间充质干细胞的样本采集以及干细胞分离和原代培养 的标准操作规程及管理程序，并在符合 GMP的标准上
24、严格执行。可行及建议样本采集方法和原代细胞分离方法。 7.3.2 新生儿脐带间充质干细胞分离与原代培养 新生儿脐带组织剥取华通氏胶，以组织块培养法或酶消化法分离新生儿间充质干细胞，贴壁法做原代培养。 7.3.3 新生儿脐带血来源间充质干细胞分离与原代培养 新生儿脐带血样本，与磷酸缓冲液 1:1稀释后，以密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁法培养。定期更换培养基直到贴壁生长的成纤维细胞样的细胞达到汇合。 7.3.4 新生儿胎盘间充质干细胞分离与原 代培养 剥取胎盘羊膜、绒毛膜或绒毛组织，以酶消化法分离胎盘间充质干细胞，贴壁法做原代培养。 7.3.5 人类脂肪间充质干细胞分离与原代培养 成人脂肪组织
25、，以酶消化法分离脂肪间充质干细胞，贴壁法做原代培养。 7.3.6 人类牙髓间充质干细胞分离与原代培养 牙齿样本，完整剥离牙髓，以酶消化法分离牙髓间充质干细胞，贴壁法做原代培养。 7.3.7 人类骨髓间充质干细胞分离与原代培养 人骨髓液样本，以密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，贴壁法作原代培养。 7.3.8 人类宫内膜间充质干细胞分离与原代培养 宫内膜组织样本以酶消化法分离子宫内膜干细胞，并做原代培养。或 经血样本以密度梯度离心法，分离子宫内膜干细胞，贴壁法做原代培养。 7.3.9 人羊水来源间充质干细胞分离与原代培养 人羊水样本， 100目滤器过滤后离心，弃上清。以培养液重悬细胞沉淀，贴壁法
26、培养。定期更换培养基直到贴壁生长的成纤维细胞样的细胞达到汇合。 7.3.10 人类母乳来源间充质干细胞分离与原代培养 人类母乳样本， 100目滤器过滤后离心，弃上清。以培养液重悬细胞沉淀，贴壁法培养。定期更换培养基直到贴壁生长的成纤维细胞样的细胞达到汇合。 SZDB/Z 1262015 9 7.3.11 人类滑膜来源间充质干细胞分离与原代培养 人类滑膜组织样本，以酶消化法分离滑膜间充质干细胞。离心 洗涤后，贴壁法培养。定期更换培养基直到贴壁生长的成纤维细胞样的细胞达到汇合。 7.4 换液 为了保证细胞所处环境的稳定，需进行换液操作，并在符合 GMP要求基础上严格
27、执行，并有严格的质量控制，需有明确的细胞鉴别特征，无外源微生物污染。 7.5 传代 根据原代细胞融合度，判断是否可以进行传代操作，传代操作应即时、迅速、密度适宜，并在符合 GMP要求基础上严格执行，并有严格的质量控制，需有明确的细胞鉴别特征，无外源微生物污染。 7.6 冻存 细胞数目达到冻存要求的细胞系，可进行冻存操作。冻存细胞需加入适当的冷冻保护液，遵循程序降温的原则， 并在符合 GMP要求基础上严格执行，有严格的质量控制，需有明确的细胞鉴别特征，无外源微生物污染。 7.7 入库 将冻存好的细胞移至液氮罐中（温度为 -196 -135 ）长期储存。并有严格的过程控制及完整的的信息录入、档案填
28、写。 7.8 细胞复苏 7.8.1 自液氮或干冰容器中取出冻存管，检查盖子是否旋紧。 7.8.2 将冻存管立即投入 37 水浴锅中，轻摇冻存管使其在 1分钟内全部融化，以 75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 7.8.3 取出细胞悬液，将解冻的细胞悬液加入含有培养基的离心管内，离心洗涤 2 3次，加入新鲜培养基重选细 胞，混合均匀，转移至培养瓶，放入 CO2 培养箱培养。 7.9 细胞出库 7.9.1 总则 人类间充质干细胞在需要使用、转移或销毁时，可执行细胞出库。执行细胞出库前应先向伦理审查委员会和科学审查委员会提出申请，通过审核后方可进行。人类间充质干细胞库应建立人类间充质干细胞使
29、用、转移和销毁的标准操作规程。 7.9.2 细胞使用出库 7.9.2.1 临床治疗需使用细胞库内细胞时，实验室出库负责人员需核对库存细胞信息和细胞使用者信息，制定严格的细胞发放计划，由实验室出库负责人员填写能够记录细胞储存位置变更的相关文件后，由质控人员监督从液氮罐中取出需要的细胞进行使 用。 7.9.2.2 科研性使用库内细胞时，需保证细胞供者在充分知情并签订知情同意书的情况下完成细胞出库，由实验室出库负责人员填写能够记录细胞储存位置变更的相关文件后，由质控人员监督从液氮罐中取出需要的细胞进行使用。 SZDB/Z 1262015 10 7.9.2.3 其他情况
30、有需要使用细胞库内细胞时（如定期检测细胞活力等），由实验室出库负责人员填写能够记录细胞储存位置变更的相关文件后，由质控人员监督从液氮罐中取出需要的细胞进行使用。 7.9.3 细胞转移出库 7.9.3.1 人类间充质干细胞库内部因整改、扩容或评估冻存干细胞质量等情况而需要进行干细胞转移时，按照具体的干细胞转移操作规范进行转移操作。 7.9.3.2 干细胞转移操作所用的时间应在规定时限内，确保干细胞及其冻存容器的温度在-135 以下。 7.9.3.3 转移过程要做好相应记录。 7.9.4 细胞销毁出库 7.9.4.1 储存时限一般应超过 20年。 7.9.4.2 当样本提供者提出反悔意见，撤销知情
31、同意书，要求销毁所提供的样本时，应遵从样本提供者的意见将样本销毁，并将样本提供者相关信息和数据从信息系统中清除。 7.9.4.3 样本的销毁应首先提出销毁申请，通过伦理审查委员会和科学审查委员会的审核后方可进行，人类间充质干细胞库应建立销毁的标准操作规范，并按照此规范操作。 7.9.4.4 应对样本的销毁进行记录，包括销毁的原因、批准和执行销毁的日 期、销毁的操作人员等。 8 安全管理 8.1 人员管理 8.1.1 人员培训与考核 8.1.1.1 人类间充质干细胞库工作人员应接受专业技能培训，并考核通过后方可上岗。干细胞制备等专业岗位需具备一定的教育背景。培训项目包括但不限于生命伦理、细胞培养
32、基础、相关仪器使用及维护方法、安全管理、质量控制、物料管理及清洁卫生等内容。 8.1.1.2 人类间充质干细胞库人员每年应至少培训并考核一次。考核未通过者，应重新接受培训，成绩合格后方可再次上岗。 8.1.1.3 人类间充质干细胞库人员培训及考核结果应有相关档案记录及查阅制度。 8.1.2 人员出入制度 8.1.2.1 人类间充质干细胞库相关区域应建立实验室人员 及外来人员准入制度，并建立相应人员准入登记记录制度。 8.1.2.2 有以下情况者不宜从事人类间充质干细胞库工作，或进入人类间充质干细胞库相关区域： a) 有严重免疫系统疾病，或正在服用免疫耐受药物者； b) 有呼吸道感染或发热症状者； c) 身体有开放式损伤者； d) 有传染性疾病或病毒携带者； e) 如有其他特殊情况，相关人员应征求人类间充质干细胞库主管人员的意见，批准后 方可进入。 8.1.
