1、 Analyst 软件应用培训教程1Analyst 软件应用培训教程关于本教程的说明：本教程为AB Sciex公司为在中国使用的客户培训的辅助材料。本教程仅提供给经过AB Sciex公司培训合格的操作人员使用。本教程内容仅限于Analyst 软件基本操作和应用部分。本教程提供的分析方法仅对用户起参考作用。本教程解释权在AB Sciex公司。Analyst 软件应用培训教程2目录1、定量分析简明流程2、成功定量分析应注意的问题3、定性分析原则与方法4、LC-MS 实验经验与仪器维护常识5、Analyst 软件操作简介：Calculator 功能与使用Library 功能与使用部分Script 功
2、能与使用其他6、Analyst 软件QTRAP 功能基本操作简介：QTRAP 扫描速度的校正QTRAP 系统的扫描方式QTRAP 系统 IDA 指南7、部分化合物液质分析参考方法和信息8、压力单位转换表Analyst 软件应用培训教程3LC-MS/MS 定量分析简明教程首先确认仪器已经校准，气体、电压工作正常一溶液配制分别将待分析化合物的标准物质配制成110 ppm (110ug/ml) 的溶液，用于注射泵连续进样，以优化质谱参数。二Q1 Scan ，确定母离子a选择或建立 Project 建立一个新项目 (Project)： 点击ToolsProjectCreat Project，出现下图对
3、话框，键入项目名称，点击“ Add All”添加项目功能，点击 OK，完成。Analyst 软件应用培训教程4b. 硬件配制：激活MS 主机，如果是API2000、3200，硬件配置文件中的质谱主机中应选择Integrated Syringe Pump 。c. 进入 MS 的Manual Tuning 界面，并设置注射泵流速510ul/min 。d选择质谱扫描方式：Q1 Scan，设置扫描范围(应包含待分析的化合物)；根据化合物性质，选择扫描极性e手动调节 DP、GS1 等参数，使喷雾平稳、待分析化合物信号灵敏度较高fMCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱(根据灵敏
4、度)，并保存方法，例如：Q1.dam Analyst 软件应用培训教程5g在质谱图区域，点击右键“Open File”打开图谱，局部放大，确定母离子的质荷比，准确到0.1amu 。，如下图，母离子m/z 应为609.3。三Product Ion Scan ，确定子离子以第一步测得值为母离子，做Product Ion Scan（MS2），手动调节CE 等参数，使母、子离子都具有一定强度，一般以母离子的强度占图谱中基峰强度的1/3 到1/4 为宜。Analyst 软件应用培训教程6MCA on ，点击Acquire，采集并存储2050 张加和图谱，并保存方法，例如：609-MS2.dam。在质谱图
5、区域，点击右键“Open File”打开图谱，选择2 个最高的子离子，如上图中，选择195、397，局部放大，确定子离子的质荷比，准确到0.1amu， 则上面两个子离子为195.2、397.3。Analyst 软件应用培训教程7四MRM，优化质谱中与化合物相关的参数以前两步选定的母离子、子离子，组成离子对，例如609.3/195.2 ，609.3/397.3 等，做MRM Scan，每个离子对的分析时间100 或 200ms。通过Edit Ramp ，分别优化Compound 项下的各参数，如DP、EP、CE、CXP 等：点击Edit Ramp ，选择要优化的参数点击OK，出现该参数的优化窗口
6、，可以根据需要改变该参数的优化范围(Start、Stop)和优化步长(Step)。不同参数需逐一优化。然后保存方法，例如609-MRM.dam。同样步骤，优化需要分析的另外化合物，分别保存方法。五、将MRM 方法转化为液质联用方法关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。单击Acquire 中Build Acquire Method ，打开上面保存过的MRM 方法，右键显示方法左边导引条中第一行Acquire Method，点击Add/Remove Device Method 添加设备：色谱泵、自动进样器选中方法左边导引条中第一行Acquire Method 参数页，设
7、置色谱同步。Analyst 软件应用培训教程8设置色谱参数，分析时间一般为0.81min ，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间 (Duration ，一般设置0.81min) ，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM 初始值为40、40、400 左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。六、源参数优化将上面用过的样品溶液稀释1001000 倍。在Tune 项下，双击 Quantitative Optimization ，选择FIA 分析，根据向导进行自动优化。Analyst 软件应用培训教程9注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。七色谱条件优化接好色谱柱，关掉Tu
8、ne ，在Acquire 栏下调出上一步优化好的方法，根据色谱柱规格和待分析体系的复杂程度设置液相色谱分离和质谱分析时间，或编辑洗脱梯度，保存方法。用新保存的方法平衡色谱柱，平衡时间为510 倍柱体积。色谱柱充分平衡后，设置Batch 进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，根据具体情况，调节流动相，优化色谱条件。用空白提取液配制同样浓度标样，按上面方法进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，峰高有无变化，有无离子抑制现象，否则调节流动相，进一步优化色谱条件。注意：等度洗脱，样品之间不需要再平衡色谱柱，若为梯度洗脱，则进下一针样品前色谱柱一定要充分平衡。八工作曲线制备用空白提取液配制一系列不同浓度
9、化合物的混合标样，按上一步方法，设置Batch 进样，例如，分别稀释浓度为0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.4 g/ml、0.8 g/ml 和1.6 g/ml 的混合标准溶液等。根据项目分析要求，有时也可只做单点校正，而不做多点线性。将采集的数据，根据峰面积，做标准曲线。根据检测项目要求，进一步考证方法的最低检测限、重现性、样品提取回收率等性能参数。Analyst 软件应用培训教程10成功定量分析应注意的问题一、准备工作1. 查阅文献2. 做好样品前处理，萃取、浓缩、分离、纯化等3. 有条件的可先在HPLC 上摸好LC 条件，能够基线分离更好，注意缓冲体系应符合MS 的要求4. 溶剂(包
10、括水) 的纯度，最好色谱纯以上5. 新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净，某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，应及时用溶剂清洗6. 质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液氮气阀开度要注意，达到稳定程度二、MS 条件优化先定性后定量1. 首先，根据待分析化合物的性质，确定离子化方式：ESI or APCI，POS or NEG 2. 用1-100ppm 的纯样，Q1 SCAN 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减，若为POS 方式，看M+1，M+18，M+23 等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化
11、方式不合适，或选择的溶剂体系不合适。3. 母离子选M+H ，或M-H 最好，但有时只有M+NH4，M+Na 等，此时CAD 能量可能需要高些。选择M+H +，还是+NH4，+Na 等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需要更换流动相，但+H 的离子通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl 可选择2 个母离子峰。4. SIM 与MRM 方式的选择：单级 Q 只能SIM，MRM 可看成2 个SIM，选择性更好。5. 再根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。通过改变CE ， 从中选定MR
12、M 需要测定的一对或更多离子对，为最后LC-MS/MS 联用做准备。6. 做Product Scan 时，注意小数点后的位数。MRM 离子对信息输入准确，灵敏度才会高。7. 先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目。8. MRM 方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度水平，使MRM 灵敏度最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC 的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC 强度来分别确定仪器参数。9. 先用注射泵优化Compound 项下面的参数，如DP、CE 及CAD 等，再接通LC
13、，用FIA 优化其他参数如温度，气流和IS 电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC 保持需要的流量。然后进行 MRM 测定。10. Curtain Gas在不降低灵敏度情况下尽量大些，温度在达到灵敏度时不用太高，气流也不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。Analyst 软件应用培训教程1111. 分辨率的选择：当样品较纯，Q3 可选LOW，提高灵敏度，若选LOW 后本底噪声太高则意义不大。三、LC 条件优化：1. 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些，定量在能有效排除干扰情况下尽量短，提高效率；内径最好选细径柱如2mm、1mm，IS 可不分流，4.6m
14、m柱用1ml 流量时如不分流灵敏度还不是最佳，不如流量低时更好。流速高，峰形好。2. 不同牌号色谱柱，效果很可能不同。3. pH 的影响：正离子方式pH 要低些，负离子方式pH 要高些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形，以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求。4. 用流动相配制标样，初步优化确定LC 条件是否合适。5. 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低。6. 进样顺序要先稀后浓。7. 洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染。8. 顺序：纯样-添加样- 实际样品。9. 流动相配制的标准品溶液优化后，用空白提取液配制标准品再次优化
15、，考察干扰情况，空白添加再提取后，考察回收率。10. 用空白提取液配制标准样品做工作曲线，可以有效排除干扰因素。四、前处理方法的优化1. LC，MS 都优化过，还是达不到灵敏度要求或无法检测，需要改进提取方法2. 离子抑制：改变前处理方法或LC 条件3. 内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。还可利用同位素标记的同一化合物作为内标。4. 衍生化：有时有助于使信号增强，且稳定，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测定。五、数据处理1. 最低检出限，信噪比3:1，定量限10:1 2. 同一物质几对离子的比例应相对
16、恒定，误差不超过15%峰面积，比使用峰高定量准确3. 当浓度低，信号弱，自动积分不准时，可对峰面积手动积分4. 平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值5. 曲线过零点时，可用4 个点；不用，则需要5 个点6. 线性范围太宽，有时意义不大Analyst 软件应用培训教程12定性分析原则与方法一、准备工作1. 核对样品名称、编号2. 通过询问样品提供人，查阅文献等，了解样品其他知识，例如熔点，沸点，溶解性等理化性质以及样品来源、合成路线、光谱、波谱数据等3. 可能含有的杂质，样品大致含量4. 样品保存状况，对温度，光是否敏感5. 进行LC-MS 分析前最好大致清楚 LC 条件，使体系得到
17、比较好的分离，流动相缓冲体系符合MS 要求6. 色谱柱和管路的清洗：新的色谱柱以及分析过大量样品的色谱柱，可能要先冲洗很长时间才能干净；某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，尤其是采用针泵进样时，应先用空白溶剂充分清洗管路。7. 如果原来溶解样品的溶剂不合适LC-MS 分析，此时应用N 2 吹干，再用流动相定量溶解。溶解样品的溶剂一定要和流动相一致，否则得到的谱图不纯，峰形不好，变宽，出怪峰等等；某些固体直接用流动相不溶，可以先加一滴DMSO(二甲亚砜)，再加甲醇或乙腈等稀释。8. 进样顺序要先稀后浓，定量溶解，浓度控制在几个ppm 级，不然易污染系统，造成本底太高影响分析结果。9. 浓度非常
18、低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，样品工作液应现配现做。二、色谱柱的选择1. 选择原则：可长一些，最好能够基线分离，若做不到，可以通过提取离子(XIC) 来得到较好的色谱图。内径无要求，粗细均可，但注意应使流动相的流速与色谱柱的内径相匹配(一般，4.6mm 柱，流速1ml/min；3mm 柱，流速500ml/min；2.1mm 柱，流速200ml/min；1mm 柱，流速50ul/min 左右)。2. 流动相流量大小，MS 分析前是否需要分流，取决于使用的离子源。一般API2000/3000，流速高于600ml/min ，需要分流；对于API3200/4000/50
19、00， 由于使用Turbo V 离子源，流速低于2ml/min 的情况，皆不需要分流。3. 要对各种厂家的色谱柱有所了解，对于一些特殊的化合物必需使用特殊的色谱柱进行分离，相关的知识可以向色谱柱供应商索取。大多数著名的色谱柱厂商都有自己的色谱柱分析数据库，里面可能会有你想要的信息。三、LC 条件的优化1. LC 梯度的设定，目的是快速分离，峰形好，缩短时间，提高效率，可以将所有化合物都冲出，防止影响下一个样品的测定。2. 采取梯度洗脱，如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等度洗脱时强很多，而且加大进样量，是提高灵敏度的一种有效措施，但是分析时间较长，且需要有色谱柱平衡的时间。An
20、alyst 软件应用培训教程13四、确定离子化方式1. 根据样品性质确定离子化方式：对于高极性的化合物，如：大分子(蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子)、胺类、季铵盐等、含杂原子化合物如氨基甲酸酯等，适合ESI；弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，适合APCI 2. 不适合用ESI 方式的化合物：极端非极性化合物如苯等；不适合用APCI 方式的化合物：非挥发性、热稳定性差的样品3. 一般碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知，可能正负都要做，有些化合物正负都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的优先用正离子方式试4. APPI，适
21、合非极性化合物，同GC/MS 有重复，但一般小型台式GC/MS，分子量范围小，APPI 比GC/MS 可测比较高分子量的化合物。五、初步定性-确定化合物的分子量1. 对于纯样品，首先可采用针泵直接进样，察看存在哪些离子，设置低的DP 电压可使谱图简单。通过改变DP，观察离子的增减，M+1 、+18 、+23、+39、2M+1 等等，初步判断分子量2. 注意要采集一段时间的溶解样品的溶剂本底信息，DP 同实际样品相同，以便扣除本底干扰，可使用高、低DP 电压各做一次，例如20V 、80V 等，一般低流速FIA 方式最适合3. 注意，当样品溶液内含有强离子抑制物质时，直接进样可能看不到化合物的分子
22、峰，此时需要经色谱柱分离或重新处理样品。4. 选择一种通用的源参数及源位置，以适合样品中大部分化合物的分析，该参数的确定可按照定量方法中FIA 优化，通常主要取决于流动相有机溶剂比例和流速。Analyst 软件应用培训教程14正离子方式常出现如下离子： 1.-Na 22 Da. higher than M+H-K 38 Da. higher than M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. higher than M+H 2.有时还可能出现M+H 2O+H、2M+H、3M+H、2M+Na 等3.
23、有意添加可以帮助确定化合物的分子量：例如有几个峰无法判断分子离子是哪个，此时加入微量Li +，有可能观察到增加 6 的峰，而通常碎片峰很少加合。负离子方式常出现如下离子：1.-TFA 114 Da. higher than M-H (113 、227 为背景离子) 2.-Acetate 60 Da. higher than M-H 3.-Formic 46 Da. higher than M-H 4.-Cl 36 Da. higher than M-H LC-MS 中常见的本底离子：Analyst 软件应用培训教程151. m/z 50-150, 溶剂离子， (H2O)nH+ ，n= 3-11
24、2 2. m/z 102, H+ 乙腈+乙酸, C4H7NO2H +,102.0549 3. m/z 102, 三乙胺, (C2H5)3NH +,102.1283 4. m/z 149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐，C8H4O3H +,149.0233 5. m/z 288, 2ml 离心管产生的特征离子6. m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 7. m/z 316, 2ml 离心管产生的特征离子8. m/z 384, 样品瓶光稳定剂产生的离子9. m/z 391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H +, 391.2843 10. m/
25、z 413, 邻苯二甲酸二辛酯+ 钠, C 24H38O4Na+, 413.2668 11. m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 同位素离子1.各种元素的同位素，基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中，这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便，如氯35 和37，溴79 和81。2.同位素分布图，可用Analyst 中计算器(Calculator)功能模拟，对于分子量较大，含C 较多的分子，最高峰可能是C 13 同位素峰，分析数据时要注意。3.利用稳定同位素合成标记化合物，如：氘等标记的化合物，再用质谱法检出这些化合物，在质谱
26、图外貌上无变化，只是质量数的位移，从而说明化合物结构，反应历程等。六、提取特征离子色谱图(XIC) 1. 利用提取离子色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS 测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LCMS 的 TIC 上往往看不到峰，此时，根据上一步得到的分子量信息，输入M+1 或M+23 等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC-MS 上都能反映出来，确定LC 条件是否合适，以后进行MRM 等其他扫描方式的测定时参考。2. 调机时，注意质量数不要偏差太大，先用标准品校准仪器，如偏差很小，可不用重新校准仪器，读取分子量数值时要多采集几次，用平均或
27、累加后得到的质谱图来读取离子质量，会相对准确。Analyst 软件应用培训教程16七、影响分子量测定的因素1. pH 的影响-正离子方式pH 要低些，负离子方式pH 要高些，除对离子化有影响外，还影响LC 的峰形2. 气流和温度，当水含量高及流量大时要相应增加3. 溶剂和缓冲液流量，流速适当高可以提高出峰灵敏度4. 溶剂和缓冲液的类型，通常正离子甲醇好，负离子乙腈好些5. 不挥发性盐的影响：大量累积，会使仪器的灵敏度下降6. 根据样品结构和性质，选择合适的液相色谱类型：正相、反相、C4、C18 7. 合适的电压：DP 电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP 电压会使多电荷离子比例低，多聚体也减
28、少8. 杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC 分离不好9. 样品浓度不够，有时需要浓缩八、样品预处理的常用方法： a）超滤b）溶剂萃取/去盐c）固相萃取d）灌注（Perfusion）净化/去盐e）色谱分离：反相色谱分离、亲和技术分离 Analyst 软件应用培训教程17f）甲醇或乙睛沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化 九、目标化合物的检测和谱图解析1. 如果是纯样，则直接进行Product Scan，找出碎片信息，同样要扣本底。做Product Scan 时，注意输入母离子质荷比小数点后的位数，输入准确，灵敏度才会高，而且不容易出错
29、，得到的谱图相对干净。2. 处理得到的数据，一种方法是库检索，另外就是手工谱图解析。为使库检索的结果准确，可使用不同的碎裂能量(如CE：20，35， 50V)各采集一张MS2 图谱 (QTRAP 用户可以使用新的CES 功能：三张图谱叠加)。因为化合物性质不同，需要CE 不同。对同一化合物，可以使用高、低能量分别碰撞，高质量区的碎片和低质量区碎片对推测结构都很重要；低碎裂能量可以判断主要碎片，高碎裂能量可看到更多信息；手工解析可以参考质谱解析书籍。Analyst 软件应用培训教程183.若为混合物或含有基质的实际样品，则首先由标准品建立方法，按照定量的步骤，选择至少2 对MRM ( 四个数据点
30、)，进行LC-MS/MS 分析，可以利用IDA 中MRM-MS2 工作流程，提高检测灵敏度。Analyst 软件应用培训教程19谱图解析：1. IDA：Full Scan-MS2，一次进样，得到大部分信息，进一步可以再细一些，采用灵敏度更高的方法确证。2. 加大DP，用串联四极杆实现拟MS 3 功能，以进行进一步的结构解析。3. 前体离子扫描(PREC)和中性碎片丢失扫描(NL)：寻找代谢产物，解析肽磷段酸化位点等4. 互补性方法，选已知同系物，研究其裂解规律，有共同的碎片或相差同样质量数，再扩展到未知物。下图为天然产物结构分析的一种思路：Analyst 软件应用培训教程20LC-MS 实验技
31、巧与仪器维护常识样品制备方面：样品处理的好坏直接关系到整个LC-MS 分析的成败，必须要有成熟规范的样品制备方法。样品预处理各步不能随意省略，如萃取、分离、去盐等。某些化合物必须化学衍生化以适应LC-MS 要求，如磷酸酯水解。若MS 信号实在太低，考虑更换样品处理方法。浓度非常低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，标准品工作液现配现用。离子化方法选择一般原则：根据样品性质确定离子化方式适合ESI(IS) 的样品类型：高极性化合物、蛋白质、肽类、低聚核苷酸等生物分子；胺类、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等适合APCI 的样品类型：弱极性/中等极性的小分子，如脂肪酸，
32、邻苯二甲酸等含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等ESI 不适合的化合物：极端非极性化合物如苯等；APCI 不适合的化合物：非挥发性样品；热稳定性差的样品碱性化合物宜用正离子方式酸性化合物宜用负离子方式如未知,可能正负都要做有些化合物正、负模式都出峰，选择灵敏度高的方式，不明确的优先试用正离子方式LC 条件的选择：1. 根据化合物类型选择流动相组成，甲醇-水，乙腈-水或甲醇-乙腈-水2. 某些化合物只有某种流动相体系才出峰3. 一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些4. 通常有机相比例高些，可以提高离子化效率5. 梯度的设定：梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例流
33、动相能满足分离分析要求时，尽量不用梯度，尤其定量分析时Analyst 软件应用培训教程216. 流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率7.是否加酸不是绝对的，具体应根据LC 的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定8.通常pH 值低时，M+H +比率高； pH 值高时，M+Na +、M+K +，或M+NH4 +比率高9.定性分析时，有时加一些NH4 + ，Li +等，可帮助确定判断母离子，对碎片较少的化合物，可以增加其质谱特征性，但会使生物大分子的质谱复杂化10.水的选择：娃哈哈纯净水比普通蒸馏水好；若在玻璃瓶中已存放时间太长，有可能变质。当本底增大，LC 压力增高，应更换水相。11.
34、溶解样品的溶剂：用流动相或甲醇、乙腈溶比用含水多的溶剂LC 峰系形好。如果常用的流动相不能很好溶解样品，可用少量特殊溶剂先将样品溶解后再用流动相稀释。12. LC 流量在色谱柱和MS 允许情况下适当高可以压缩峰宽，使峰强度提高。13.使用长的色谱柱，对定性分离效果好，但分析时间延长，如峰形仍不理想，可考虑另选其他型号色谱柱。14.柱后补偿：当不得不用高浓度TFA 时，常用异丙醇，解决信号抑制问题。柱后衍生化，有时可以增加离子化效率。调机准备1.仪器平衡时间：真空，温度，LC 流动相比例，宁可长些。2.容器注意，塑料离心管添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，干扰物信号有可能超过待测
35、物。3.LC Pump 脱气，可以快速放掉柱前部管路中液体，排净气泡；还要注意检查LC 流动相储液瓶液面的高度。仪器参数的优化：1.先用PPG 或一已知化合物校准，如偏差不大，可以不用做质量校正，但偏高、偏低要心中有数。2.先用浓度大约0.1-1ppm 的标样，通过syringe pump ，以5-10ul/min 优化Compound 项下面的参数，如DP，CE，EP，CXP 及CAD 等。3.顺序：Q1 Scan Production Scan MRM 。4.不同化合物参数有可能差别很大。5.再接通LC 用FIA 优化其他参数及源位置, (或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC
36、保持需要的流量)，优化温度和Gas1 及Gas2， CXP、CAD 、EP，优化后通常不用再改，在保证样品充分离子化的基础上，DP 低些使母离子丰度提高，总灵敏度也会相应提高。6.质量范围不要太宽，涵盖待测离子再增加20-30amu 即可。7.采样时间适当长些噪声低，当同时检测数十对离子时，MRM 采样时间可以数十毫秒；同时检测数对离子时，可100-200 毫秒。8.母、子离子输入的质量数值要选准，要根据Q1 Scan 及Production Scan 得到的结果输入，不能只是整数。当不能确定精确质量数时，可选待测质量数上下各0.1amu ，同时数对离子优化，最终找出灵敏度最佳的一对离子。例如
37、321.0-152.0，321.1-152.0，320.9-151.9。9.若样品较杂，同一化合物要选择几对母、子离子，经进样实验找出哪对有干扰，去掉，保留不易受干扰的1-2 对离子。Analyst 软件应用培训教程2210.每对离子各参数分别设，如DP、CE、Time 等，对较弱离子对，采样时间可适当长些。11.运行Ramp 分别优化各参数一次，Step 选小些更准，范围不用太宽，每次优化重复两次以上，以减小偶然误差。12.根据LC 流量和流动相组成确定温度和Gas1 及Gas2，当流量大，水相多时，温度及气流要大。离子源喷雾位置是根据LC 流量调节的，基本上流量固定位置就固定。13.调节喷
38、雾电压，但太高有可能会导致放电。14.调节Q1 及Q3 分辨率。15.许多源参数互相影响，需要反复细调, 使信噪比得以改善。仪器清洗：1.做完含生物体液样品后，LC 需多冲些时间，使吸附到色谱柱上的干扰物完全洗脱下来。2.若本底高，清洗离子源喷雾针管和orifice，喷雾针可拆下超声清洗，orifice 要用无尘纸沾溶剂 (甲醇:水1:1) 擦。3.清洗管路，可从源上拆下Peek，或将源从仪器上取下，用Syringe Pump 洗，换不同溶剂，极性、非极性、酸等轮番冲洗，最后甲醇/水。4.清洗进样针，进样阀5.用过含酸的流动相后，色谱柱，离子源都要用甲醇/水冲，延长仪器和色谱柱的寿命。6.做完
39、MRM 后，用手动使仪器处于Q1 SCAN ，降温，停大流量 LC，最后关气，但管路中最好有些水，不要完全干。提高灵敏度的其他方法：1.做纯标样时，Q1、Q3 的分辨率可以选择Low，S/N 提高一倍，而噪声并不增高；若复杂混合物，因为有基质干扰，不宜选LOW。2.适当加大进样量，可以延伸检测下限。3.浓缩样品，测定后再推算回原始浓度。4.谱图平滑后可提高信噪比，可多次平滑。5.负离子模式时，使用零级空气比氮气灵敏度提高。6.适当提高检测器电压。7.当化合物很稳定不易产生碎片，可考虑采用Ar、Xe 等原子量较大的气体，以增加碰撞能量。仪器无信号诊断与处理：1.在需要工程师到达之前，首先说明出现
40、此现象的时机，是正在工作时突然出现，还是一段时间没用仪器，开机后出现的，在此之前，动了仪器哪些部位，是某些扫描方式没有信号还是都没有信号。2.例如MRM 无信号，先看Q1、Q3 有无信号。若Q1 、Q3 有信号，则通常是Analyst 参数设置问题，若无，则继续下一步。3.看有无本底信号，即有没有电噪声，如有，则可能是离子源或软件问题。4.检查真空，Q1 SCAN 方式时，通常应该0.7-1.210 -5 torr 之间，过好可能是Orifice 堵塞，过差则可能是漏气或真空泵有问题。Analyst 软件应用培训教程235.电源电压是否超限，UPS 显示正常否？6.更换了离子源以后，高压线是否
41、插好到位？喷雾电压设置正确与否? 7.各路气体压力是否正常，阀门是否打开，加热气开了吗？8.离子源喷雾针重装后，有无漏气，漏液？有无液体从针外壁流出？9.管路有否堵塞，一节一节拆开测试，看通否；喷雾是否均匀，泵压是否过高。通常不接色谱柱，200ul/min 流速，压力应不超过几十psi。10.若为APCI，检查流速是否过低 (如没接LC，只用注射泵 )，放电尖端对正方向没有，放电电流是否加上? 11.若为APPI，有没有通甲苯？12.若为NanoSpray，检查喷雾针是否损坏：针尖碰断了没有？高压放电烧坏或样品堵塞针尖？外涂金属层被磨掉？加不上高压，需提高喷雾电压才有信号等，都要更换新的喷雾针
42、。13.有无气泡，注射针里面，LC 流动相管路是否有空气，流速低时多等一会儿，可手推一下注射针，帮助液体快速到达喷雾针。14.诊断软件的使用要在工程师指导下进行，一定要Off Line 15.在工程师指导下，可用万用表测量各点电压值，判断故障点。进样管及spray tube 堵塞：1.用Syringe 推：直线喷出 没有堵塞2.若堵，取下用50 水/50 甲醇超声清洗3.超声仍无效，则需要更换进样管及喷雾针Orifice 堵塞：现象：灵敏度下降或真空度异常的好处理方法：a. 50 水/50 甲醇清洗orifice 外部b. 不能解决问题时再清洗orifice 内部仪器灵敏度低时的诊断与处理：1
43、.首先按照无信号处理方法检查。2.Orifice 脏也可引起真空变差，当Curtain Gas 很高才好，说明脏了，清洗。3.机械泵油半年以上没换，或颜色加深，换油；低于刻度下限，补充。注意要用同型号的油。4.管路漏液，样品没有完全进到离子源里。5.管路部分堵塞，喷雾时断时续。6.先调出安装仪器时的PPG 等方法，用注射泵Syringe Pump，进PPG 看看，CAL 漂移否，若CAL 不对，造成质量数无法选准，重新校准仪器。7.若注射泵采集标准品正常，则再看样品，然后用Reserpine 等标准品，接通LC ，如果有手动进样阀，可从此处进样，看FIA 有无峰，若无，则可能是LC 及源参数设
44、置问题。8.如果正常，则排除MS，再自动进样，看FIA 有无峰，若无，则可能是自动进样器问题。9.若FIA 正常，则再继续接上色谱柱采样，判断是色谱柱问题还是流动相问题。10.离子化方式是否对路，如非极性物质用ESI 效果很差，有机酸采用正离子方式没什么信号。Analyst 软件应用培训教程2411.样品本身的问题，如样品没有完全溶解，浓度不够，所用溶剂与流动相不匹配等。12.样品存贮时间过长，保存条件不好，则会因分解或被吸附等原因导致浓度降低。13.放在自动进样器中的样品小瓶内套管底部有气泡，没取到样品，或针头位置太高，而样品液面太低。14.前处理步骤中，标准品、内标样品是否加进，提取过程中
45、有无遗洒。15.离子抑制，改变前处理方法或LC 梯度，或换为 APCI 也可以降低部分离子抑制效应。16.离子对质量数输入准确否，有无错误？数据重复性差时的诊断与处理：1.参考前面各步骤2.Curtain Gas 太低，有周期性降低现象。3.Dwell Time 太长，每个色谱峰采样点太少，重现性下降，一般一个色谱峰，至少8 点以上；Dwell Time 太短，则噪声会增高，使信噪比降低。4.新色谱柱没有充分平衡，旧色谱柱老化，重新清洗活化，或更换。5.离子对的选择有问题，如：M+Na 做为母离子不稳定，子离子若为脱水峰亦不太好。6.源温度太高，导致样品分解。7.加样前与标液分别平行做处理，观
46、察有无区别，若标准品溶液无问题，而样品重复性差，则问题可能出在基质的干扰或前处理方法不当。8.稀释配制样品的移液枪，移液管，容量瓶等有无问题。9.某些样品正离子改为负离子试试，干扰少，重复性会好些。10.样品管中吸附 (尤其低浓度)，导致不成线性，如氨基糖甙，加些甲酸或乙酸，可以改善。11.尽量使用流动相溶解样品，如果不同，例如用甲醇溶解样品，流动相是乙腈/水，则出峰乱，稀释时残存甲醇都会有影响。12.梯度洗脱后平衡时间不够，或脏东西没洗干净，累积使得，彻底洗柱子。13.手动阀如果没问题了，再看自动进样器有无问题。14.空调波动，与仪器在同一供电线路上，启动/停止会影响仪器真空，进而影响实验结
47、果。15.当液氮剩不多时，及使用钢瓶时，尤其注意压力变化。16.流动相虽有在线脱气，但装入前超声还是必要的。17. Peek 吸附， FIA 时明显，例：分析四环素，乙腈/水：（0.1%乙酸）30/70， 由开始时一个峰最后可能变为两个峰。另外保留时间也会改变，应该充分冲洗管路。软件死机时处理方法：1.由于鼠标操作太快，打开窗口太多造成的死机，重启Analyst 软件，正在采集的数据不会丢失，用CTRL-ALT-DEL， Windows 任务管理器结束Analyst 任务。尤其当采集数据时，实时查看谱图不要用箭头翻看前后一次的数据，可重新打开一个新的谱图。注意不要在一张谱图上过多次计算信噪比，
48、本底范围也不要选择太宽。2.当Syringe Pump 到头时（API2000，QTRAP ，QSTAR），右下角图标变黄，须先点击Standby ，再点击Ready。3.当由于HPLC 的原因，如漏夜等引起图标变红，首先排除HPLC 故障，并重新开Analyst 软件应用培训教程25关所有HPLC 设备一次，待自检通过后，先 Deactivate，再重新激活。4.Analyst Services Stop ，中断计算机与仪器通讯，本次采集的数据丢失；重启Windows-正在采集的数据会丢失。5.由于Exhaust 排气管不通畅，引起图标变红，首先清理排气管，如果图标仍然是红色，有可能是阀憋住
49、了，要打开Exhaust 进气口，放气，然后再重新接好。6.以上步骤都失灵时，在C 盘的Program FilesAnalystFrimware 中双击SCU21，按F4， Reset System Controller ，等仪器主机上指示灯不再闪硕，重新进入Analyst。7重装Analyst 软件前，先将API Instrument 中InstrumentDATA 和Parameter Setting 两个文件Copy 出来，然后卸载Analyst 软件，再重装，不要修复。还要用SCU21 查看Frimware 版本号，如不对要Download，参见软件安装说明。注意计算机用户名，不能有符号，只能是字母和数字，还要以管理员身份登陆。8当软件运行速度很慢，经常死机，可考虑增加计算机内存，但要DELL 专用的内存。9如果出现不能控制附加设备情况，检查是否需要加补丁程序，具体看Hotfix 的说明。10有时由于计算机的问题，引起软件工作异常，如提交后不采集数据等，试试重新编辑Method，Batch，Configuration。11经常清理计算机磁盘碎片，定期查杀病毒，如果中毒太深，可能需要硬盘格式化。12.Analyst 1.4 每次启动出
