1、四种白血病细胞血涂片染色方法的比较 李涛 李文哲 王霖涛 薛瑞冰 孙栾彪 张雨薇 姬新 颖 河南省核蛋白基因调控国际联合实验室 河南大学基 础医学院 摘 要： 目的比较四种染色方法制作白血病细胞血涂片标本的效果。方法Wright氏 染色法:染色时间分别为 10、15、20 min;Giemsa 氏染色法:染色时间分别 10、 15、20 min;Wright 氏-Giemsa 氏混合染色法, 染色时间分别10、15、20 min;Wright氏-Giemsa 氏分步联合染色法, 染色时间分别10、15、20 min。结 果Wright 氏-Giemsa 氏分步联合染色法对前三种染色法起互补作用
2、, 其染色法 制作的标本兼有前三种方法的优点, 即对细胞核着色程度适中, 细胞核结构和 色泽清晰艳丽, 对细胞核结构的识别较佳;可以使细胞质颗粒着色较好, 色泽纯 正, 易于观察辨认。 结论Wright氏-Giemsa 氏分步联合染色法制作的标本, 染 色效果最佳, 易于观察辨认, 值得推广。 关键词： 血涂片标本; Wright 氏-Giemsa氏分步联合染色法; 白血病细胞; 染色; 作者简介：李涛 (1964-) , 女, 陕西蒲城人, 实验师, 研究方向:病理学实验技 术及实验教学。 作者简介：姬新颖 (1963-) , 男, 河南洛阳人, 博士生导师, 教授, 研究方向: 基础医学教
3、学及科研, E-mail:。 基金：河南大学医学院 2016年度卓越医师计划项目 (16NA053) Comparison of four types of staining methods for leukemia cells in blood smear LI Tao LI Wenzhe WANG Lintao XUE Ruibing SUN Luanbiao ZHANG Yuwei JI Xinying Henan International Joint Laboratory for Nuclear Protein Regulation, School of Medical Scienc
4、es, Henan University; Medical College, Henan University; Abstract： ObjectiveThe effects of four kinds of staining methods on the preparation of leukemia cells were compared.MethodsBy Wrights Staining, the staining time was 10 min, 15 mim, 20 min; 2. By Giemsas staining method, the dyeing time was 10
5、 min, 15 min and 20 min; 3. By Wright Giemsa mixed staining method, the dyeing time was 10 min, 15 min and 20 min; 4. By Wright Giemsa step by step staining method, the staining time was 10 min, 15 min and 20 min. ResultsWright Giemsa step by step combination method was complementary to the first th
6、ree staining methods. The stained samples had the advantages of the first three methods which included the proper staining of the nucleus with clear structure and color of the nucleus, better identification of the nuclear structure and better staining of cytoplasm particles and easier observation of
7、 its structure.ConclusionWright Giemsa step by step combination of staining method produced the best results, made observation and identification easier, and therefore worth being recommended to the professionals. Keyword： blood smear specimen; Wrights Giemsas step by step combined staining method;
8、leukemia cell; dyeing; 白血病 (Leukemia) , 亦称作血癌, 是一种造血系统的恶性肿瘤, 也是我国最 常见的恶性肿瘤之一。 白血病患者过分生产不成熟的白细胞, 妨害骨髓的正常工 作, 使得骨髓生产其他血细胞的功能降低, 其结果严重威胁患者的生命安全 1-4。结合临床症状在患者的外周血中检出白血病细胞是确诊白血病的诊断依 据。制作结构清晰的白血病血涂片标本对临床诊断和组织学教学具有重要意义 5-7。由于白血病患者血液中含有过多的未成熟白细胞 (即白血病细胞) , 实 际操作中染色效果多不理想, 影响观察分类与诊断, 为寻找较好的血涂片染色方法, 我们将四种染色方法
9、用于白血病标本制作, 并对染色效果进行比较观察, 旨在得到更好的血涂片染色效果。 1 材料与方法 1.1 主要仪器 恒温保温箱, 电子秤, 秒表, 显微镜, 载玻片, 盖玻片, 滤纸, 移液器, 漏斗, 玻璃棒, 乳钵乳棒, 烧杯, 储存瓶, 胶头滴管, 中性树胶, 棉签。 1.2 主要试剂的配制 1.2.1 Wright 氏染液 参考血液细胞学 (第2版) 8配制。称取干燥的 Wright氏染料 0.1 g, 甲醇 (AR) 60 m L。将Wright 氏染料放置乳钵内, 用乳棒轻轻研磨成粉末;加少许甘 油或甲醇溶解研磨, 使染料在乳钵内彻底成光滑细致的粉末而无染料粉粒沉着, 再加较多量甲
10、醇研磨呈一面镜光亮;静置片刻, 将上层液体倒入一清洁棕色瓶内 贮存;乳钵内再加甲醇研磨, 重复数次, 直至乳钵内染料及甲醇用完为止。 摇匀, 过滤, 滤液密封瓶口, 存室温暗处, 储存愈久, 则染料溶解、分解就越好。 1.2.2 Giemsa 氏染液8 配制方法:取Giemsa 氏色素染料1 g 加入66 m L 甘油, 混匀, 60保温溶解 2 h, 再加入66 m L甲醇混匀, 放置 24 h, 过滤, 贮存在棕色瓶内, 即配成 Giemsa 氏染液原液。 此原液用前用PBS (p H 6.8) 稀释10倍左右就可以使用此为Giemsa 氏染液工作液。工作液可室温保存 1 mon左右。 1
11、.2.3 磷酸盐缓冲液 (PBS 6.8) 取0.2 mol/L 磷酸二氢钾溶液 250 m L, 加0.2 mol/L氢氧化钠溶液 118 m L, 用 蒸馏水稀释至1 000 m L, 即得。 1.3 标本采集、涂片 白血病血标本取样于河南大学第一附属医院血液病科, 诊断为慢性粒细胞白血 病患者。使用移液器吸取混匀血样, 滴取2L 血液于洁净载玻片上, 用推片在 血样前方接触血滴, 使血滴均匀呈一直线, 推片与载玻片呈45角, 用力均匀 将血滴推开, 自然晾干。大量制作教学标本可一次推出所需血涂片, 晾干待用。 1.4 染色 1.4.1 Wright 氏染色法 Wright氏染色法参考实用
12、组织学技术 (第2版) 9。将3片血涂片平放在染 色架上, 分别加Wright氏染液23滴, 使之覆盖整个血涂片, 染色0.51.0 min; 滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水, 与Wright氏染液混匀分别染色 10、15、20 min, 然后用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液 (注意:勿先倒去染液或直接对血涂 片冲洗) , 待自然干燥后, 中性树胶封片, 即可放置血涂片于显微镜高倍镜下 进行观察。 1.4.2 Giemsa 氏染色法 Giemsa氏染色法参考文献8。Giemsa氏原液用前用 PBS (p H 6.8) 稀释10倍 左右为Giemsa氏工作染液, 此工作染液需要新鲜配制。将 3片标
13、本血涂片用无 水甲醇固定3min, 滴加Giemsa 氏工作液, 将血涂片分别染色10、15、20 min。 用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液 (注意:勿先倾倒去染液或直接对血涂片 冲洗) , 置于空气中干燥, 用中性树胶加盖玻片封片, 于显微镜高倍镜下进行 观察。 1.4.3 Wright 氏-Giemsa 氏混合染色法 Wright氏-Giemsa氏混合染色法参考文献9。将Wright氏染液Giemsa 氏工 作染液磷酸盐缓冲液 (PBS6.8) 按照516 体积混合均匀。 将3 片血涂片平 放在染色架上, 甲醇固定 25 min, 甩干;加混合染液数滴, 使之覆盖整个血涂 片, 分别染
14、色 10、15、20min, 取出涂片, 然后用自来水缓慢从血涂片一端冲洗 去染液 (注意:勿先倾倒去染液或直接对血涂片冲洗) 。置于空气中自然干燥, 用中性树胶及盖玻片封片, 放置于显微镜高倍镜下进行观察。 1.4.4 Wright 氏-Giemsa 氏分步联合染色法 将3张血涂片平放在染色架上, 首先加Wright 氏染液23滴, 使覆盖整个血涂 片, 固定 0.51.0 min, 滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水, 与染液混匀分别染色 10、15、20 min, 用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液。然后滴加 Giemsa氏 工作染液, 将血涂片分别染色 10、15、20 min。取出血涂片,
15、再一次用自来水 缓慢从血涂片一端冲洗去染液 (注意:勿先倒去染液或直接对血涂片冲洗) , 置 于空气中自然干燥, 用中性树胶加盖玻片封片, 置于显微镜高倍镜下进行观察。 2 结果 2.1 Wright 氏染色 用Wright 氏染色法分别染色 10、15、20 min, 红细胞呈橘黄色, 白血病细胞核 呈紫红色, 细胞质颗粒呈淡蓝色。染色时间无论长短细胞核均易着色, 见图1。 2.2 Giemsa 氏染色 用p H 6.8 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 配制的工作液, 分别染色10、15、20 min, 红 细胞呈蓝灰色, 白血病细胞核呈紫蓝色, 中性颗粒浅紫色;而p H6.8则核呈蓝色, 见图
16、2。 2.3 Wright 氏-Giemsa 氏混合染色 分别染色10、15、20 min。红细胞呈灰黄色或灰色, 白血病细胞核呈紫红色, 细 胞质颗粒呈灰蓝色或淡紫色, 染色时间无论长短则细胞核易着色, 细胞核结构 清晰, 色泽艳丽, 见图 3。 2.4 Wright 氏-Giemsa 氏分步联合染色 分别染色10、15、20 min。红细胞紫粉色, 白血病细胞核呈紫红色, 细胞质颗 粒呈淡蓝色;细胞核结构清晰, 色泽明亮透彻干净, 富有立体感。染色时间短 (10 min) 则细胞核难着色, 见图4。 3 讨论 血涂片是血液细胞学检查的基本方法, 应用极广, 特别是对各种血液病的诊断 有很大
17、价值。 但血片制备和染色不良, 常使细胞鉴别发生困难, 甚至导致错误结 论。 例如, 血膜过厚细胞重叠缩小, 血膜太薄白细胞多集中于边缘, 因此, 染色 良好的血片是血液学检查的基本技术之一10-12。 本研究所采用的四种染色法, 各有优缺点:Wright 氏染色法的优点是染色时间 短, 结果出现快, 较适于临床检验, 但其染色过程不易掌握、易污染是其缺 点;Giemsa 氏染色法的染色液不易污染是其最大的优点, 但是, 染色效果对染 液p H 值要求高, 较易偏碱, 不易控制, 经过反复多次试验, 以p H 6.8 染色效 果最好 (图2) 。Wright 氏-Giemsa氏混合染色法虽能对
18、前两种染色法起互补作 用, 但对红细胞着色不均匀, 且染液变性快、易污染, 也不适于教学标本染色 (图3) 。Wright氏-Giemsa氏分步联合染色法的优点是红细胞呈紫粉色, 白血 病细胞核呈紫红色, 细胞质颗粒细腻呈淡蓝色, 细胞核结构清晰, 色泽明亮透 彻干净, 富有立体感, 着色保持时间久;而缺点是染液变性快、易污染, 适合新 鲜配制, 即适用于大批量制作组织病理学和组织胚胎学教学用片 (图 4) 。 综上所述, 我们的体会是:血液标本一定要新鲜;四种血涂片滴加染液后, 不要 直接倾倒去染液, 否则易使染液沉淀在血涂片上, 影响结果观察;直接用自来水 冲洗比用蒸馏水或缓冲液冲洗更方便
19、、彻底和节约。 图1 不同时间 Wright 氏染色结果比较 下载原图 图2 不同时间 Giemsa 氏染色结果比较 下载原图 图3 不同时间 Wright 氏-Giemsa氏混合染色结果比较 下载原图 图4 不同的 Wright 氏-Giemsa 氏分步联合染色结果比较 下载原图 参考文献 1Widick P, Winer E S.Leukocytosis and LeukemiaJ.Prim Care, 2016, 43 (4) :575-587. 2Onuoha C, Arshad J, Astle J, et al.Novel Developments in Leukopenia an
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